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米糠是稻米加工过程中的副产品。对米糠进行深层次的转化,有利于提升农副产品的价值,提高农民的收入。灰树花是一种珍贵的食药两用真菌。灰树花多糖具有多种生理活性功能。以廉价的米糠为培养基,生产灰树花多糖,具有一定的学术创新意义和实用价值。
应用紫外诱变技术,对灰树花出发菌株Gr0301进行处理。从5株诱变株中选出一株生物质量和多糖产量明显优于原始菌株的突变株YUV03。突变株YUV03在2%(wt%,下同)的米糠(加水蒸煮米糠并使用全部过滤液)液体培养基上,在250mL三角烧瓶装样40%、接种量10%、25℃、150r/min摇床转速等条件下,培养5d,菌丝干重和总多糖的量分别比原菌株的提高了32.1%和55.2%,每100mL培养基分别可得2.496g和288.1mg。将YUV03菌株在综合PDA斜面上转接4代,未出现退化现象,表明所得突变株为所要选育得到的新菌株。
研究灰树花米糠液体培养基组成和液体培养的外部培养条件。采用摇瓶发酵法,在装样量为40%、接种量为10%、摇床转速为150r/min、温度25℃的条件下,培养5d,研究不同碳源、氮源和氢离子浓度(pH值)对灰树花菌丝体干重及胞外多糖产量的影响。结果表明,灰树花深层发酵最适的碳源为葡萄糖,最适的氮源为蛋白胨。以菌丝干重、胞外多糖、胞内多糖、总多糖为试验指标,对碳源、氮源和氢离子浓度进行正交试验,综合考虑各指标得到的优化培养基为:葡萄糖4%(wt%,下同),3%的米糠,其pH值为5.0。采用优化培养基,在装样量为40%、接种量为10%、摇床转速为150r/min、温度25℃的条件下,培养5d,得到总多糖为452.4mg/100mL培养基。以得到的优化米糠培养基为基础,研究灰树花液体培养的外界条件,包括温度、接种量、摇床转速和装样量。以总多糖为指标得到较优的培养条件为:摇瓶装样量40%,温度为25℃,转速为170r/min。
研究灰树花米糠固态培养基组成和培养条件。在250mL三角烧瓶中装入含15g米糠的固体培养基,在25℃、摇床转速150r/min、10%的接种量的条件下,培养7d,研究外加不同碳源、氮源对灰树花固态培养所得多糖含量的影响。结果表明,灰树花在米糠上固态发酵最适的外加碳源为葡萄糖,最适的外加氮源为蛋白胨。针对一定量的米糠,对水分、葡萄糖、蛋白胨和pH值这四个因素分别取四个水平按L16(45)进行正交试验,以总多糖为指标的最优米糠固体培养基为:水分含量为65%、蛋白胨含量为0.5%、葡萄糖含量为4%、pH值为5.5。采用最优培养基,250mL三角烧瓶装入含15g米糠的固体培养基,在25℃、摇床转速150r/min、10%的接种量的条件下,培养7d,得到米糠固态发酵的多糖含量以原始米糠为标准计算为3.57%。在优化培养基上,研究灰树花固体培养的外界条件,包括温度、接种量、摇床转速和装样量。以多糖含量为指标得到较好的摇瓶条件为:250mL三角烧瓶装优化的含15g米糠的固体培养基,发酵温度为25℃,摇床转速为170r/min,发酵时间为11天。多糖得率以原始米糠为标准计算,可达4.52%。
初步分离鉴定了灰树花在米糠固体培养基上培养所得多糖。发酵后的产物经热水浸提、乙醇沉淀、Sevage法脱蛋白、透析等操作后,得到米糠精多糖FC。精多糖FC用蒸馏水复溶后,进一步经DEAE-52纤维素层析,得到纯多糖MK1、MK2,对MK1、MK2进行紫外扫描,确定无蛋白质、多肽和核酸的存在。三种样品的红外光谱扫描图均显示了在4000~400cm-1区间具有一般多糖类物质的特征吸收峰。