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研究背景非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)预后差,5年生存率低于15%,其原因在于NSCLC极易发生区域性淋巴结和远处器官转移。近年的研究表明,肿瘤微环境中的炎症浸润和脉管形成是肿瘤恶性进展的重要因素。白介素-17(IL-17)是新近发现的一类前炎症因子,分泌IL-17的CD4+T细胞称为Th17 (interleukin 17-producing T helper cells)细胞,在肿瘤微环境中起决定免疫效应方向的重要作用。目前越来越多的证据表明IL-17阳性细胞存在于多种炎症相关性肿瘤中,包括前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌和NSCLC。不少实验证明IL-17可促进肿瘤血管生成,并在人原位卵巢癌、肝癌和NSCLC中发现IL-17与血管密度相关。然而,也有一些实验表明IL-17可促进免疫系统介导的抗肿瘤反应。因此,关于IL-17在NSCLC预后中的作用仍不甚清楚;IL-17虽然被证明可促进肿瘤血管生成,但其与另一脉管形成过程——淋巴管生成的关系却少有研究。进一步研究表明,IL-17的胞内信号通路与IL-1和Toll样受体相似,而IL-1β可以促进靶细胞内VEGF-C的表达;另一方面,IL-17可以促进靶细胞分泌IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β和血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子。因此,我们有理由进一步推测:IL-17可能通过促进NSCLC细胞分泌VEGF-C加强淋巴管生成,从而促进肿瘤的恶性进展。目的阐明IL-17对NSCLC淋巴管生成及其预后的影响,探讨其具体机制。方法1.应用连续切片观察IL-17与CD4、CD8(T细胞表面标志)、CD68(巨噬细胞表面标志)的共表达,以鉴定IL-17的细胞来源。免疫组织化学法检测IL-17蛋白在52例NSCLC组织中的表达,并分析IL-17表达与肿瘤临床病理特征、淋巴管生成及预后的关系。2.免疫组织化学法检测IL-17、VEGF-C、淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD)在36例NSCLC组织中的表达,卡方检验和T检验分析IL-17、VEGF-C与LVD之间的相关关系。3. MTT实验检测IL-17对淋巴管内皮(lymphatic endothelial cells, LECs)细胞生长的影响,Transwell实验和管样结构形成实验分析IL-17作用于Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell, LLC)的条件培养基对LEC细胞迁移和管样结构形成的影响。流式细胞仪技术检测LLC和LEC的IL-17R的表达。4.以Lewis肺癌细胞(LLC)为主要体外模型,应用定量RT-PCR和ELISA方法检测IL-17刺激LLC表达VEGF-C mRNA和蛋白的时间和剂量效应关系。Western blotting检测IL-17刺激A549细胞表达p-ERK1/2的情况,用p-ERK1/2特异性阻断剂PD98059阻断p-ERK1/2的激活,观察IL-17上调VEGF-C表达是否受到抑制,明确p-ERK1/2 MAPK信号通路在调控IL-17介导的VEGF-C上调表达中的作用。结果1. 52例NSCLC患者的组织切片免疫组化染色发现,25例NSCLC组织表达IL-17(25/52, 48.1 %)。大部分IL-17阳性细胞表现出典型的T细胞和中性粒细胞的形态特征;CD4、CD8阳性细胞部分与IL-17阳性细胞位置一致。IL-17与肿瘤生物学的相关性分析发现:IL-17表达阳性的患者表现出肿瘤进展的临床病理特征;高表达IL-17状态与吸烟状态和TNM分期相关,而与年龄、性别、分化程度和病理学分型无关;IL-17阳性表达患者的无病生存期(disease free survival,DFS)和总生存期(overall survival,OS)显著低于IL-17阴性表达的患者,提示IL-17表达与患者预后差相关。单因素和多因素分析进一步表明,肿瘤内的IL-17的表达是DFS和OS的独立预后因子。2.检测36例NSCLC石蜡切片内LVD、VEGF-C表达与瘤内IL-17表达的关系,发现IL-17阳性表达患者的LVD(11.1±5.3)高于IL-17阴性患者(5.8±4.2)(P<0.01);IL-17表达与VEGF-C的表达具有相关性(P<0.01)。3. IL-17对淋巴管内皮细胞(LEC)的增殖、迁移和管样结构形成没有直接作用;但是相对于LLC培养上清,LLC/IL-17条件培养基可以促进LEC的迁移和管样结构形成(P <0.05)。4.外源性IL-17可显著增加LLC细胞VEGF-C的表达。LLC细胞经用不同浓度的IL-17作用3 h, VEGF-C mRNA表达呈剂量依赖性增加,其表达在IL-17浓度为10,100ng/ml时与对照组之间的差异均有统计学意义,并在IL-17浓度为10ng/ml时达到峰值,为对照组的1.40±0.17倍(P <0.05)。LLC细胞经用10 ng /ml的IL-17作用48 h,VEGF-C蛋白表达量与对照组之间的差异有统计学意义(203.0±13.1 vs 277.3±14.0, P <0.05)。A549细胞用IL-17刺激后,可见VEGF-C表达上调和p-ERK1/2激活,提前给予p-ERK1/2特异性抑制剂PD98059可抑制IL-17介导的VEGF-C表达上调。结论1.人NSCLC组织中IL-17的表达是肺癌预后的独立危险因子,其IL-17主要来源于T细胞和中性粒细胞。2. IL-17与人肺癌组织LVD和VEGF-C表达成正相关,可能通过促进VEGF-C表达促进了淋巴管生成。3. IL-17对LEC的增殖、迁移和管样结构形成没有直接的促进作用,但IL-17作用于LLC细胞之后的上清可以促进LEC的迁移和管样结构形成,这与LEC上不表达IL-17R但LLC表达IL-17R有关,提示IL-17可通过对NSCLC细胞的作用而进一步促进后者的淋巴转移。4. IL-17可以促进肺癌细胞株VEGF-CmRNA和蛋白表达,且IL-17上调VEGF-C表达与p-ERK1/2信号通路激活有关。