三-(β-氯乙基)磷酸酯(Tris(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)作为优良的阻燃增塑剂,广泛用于建筑材料、家具、儿童玩具、电子产品和食品包装袋等产品的制造过程中。TCEP作为添加剂与材料主要以非化学键方式结合,因此,会随着产品的不断磨损或长时间的使用而挥发到环境中,且在自然条件下极难降解。TCEP可通过空气吸入、饮食摄入和皮肤接触等多种途径进入体内。已有大量研究发现,TCEP具有生殖毒性和发育毒性,能够影响心脏、肝脏、肾脏和睾丸等器官的发育。近些年也有少量关于TCEP神经毒性的报道,但有关TCEP对神经细胞的毒性作用机制尚不清楚。大脑是机体中代谢活性最旺盛的器官,需要大量的ATP供能,线粒体通过呼吸作用氧化葡萄糖产生ATP,以满足脑细胞的功能活动需求,因此线粒体的功能活动正常,对脑结构和功能正常具有重要的意义。而线粒体在合成ATP过程中会释放活性氧自由基(Reactive oxide species,ROS),过量的ROS可导致细胞过氧化损伤。已有报道TCEP可诱导细胞的氧化应激相关蛋白表达异常。细胞中ROS主要产生于线粒体,但目前为止,尚无TCEP对神经细胞线粒体功能影响的报道。因此,本研究以小鼠脑神经瘤细胞系(N2a)为实验材料,探讨TCEP是否可以诱导线粒体的过氧化损伤及可能的机制,以及TCEP对自噬调节蛋白HDAC6表达和活性的影响,以期为TCEP的神经毒性作用研究提供新的实验数据。本试验用不同浓度的TCEP (25、50、75、100 λM)分别处理N2a细胞24 hr后,通过CCK-8法检测TCEP对细胞活性的影响;并利用DCFH-DA法、TBARS比色法和羟胺法分别检测细胞中ROS水平、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性的变化,以判断TCEP是否对细胞造成过氧化损伤。用25或50 μM抗氧化剂维生素E (Vitamin E, VitE)预处理细胞1 hr后,再用50 μμMTCEP处理24 hr,使用DCFH-DA法检测线粒体中ROS水平,利用JC-1技术检测线粒体膜电位的改变,又通过比色法检测线粒体功能的相关指标Ca2+-ATPase、细胞色素c (Cytc)氧化酶活性的变化,来判断线粒体的过氧化损伤的可能机制;使用免疫印迹技术检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3含量的改变,以探讨线粒体依赖的细胞凋亡过程的变化;利用免疫印迹技术检测自噬相关蛋白HDAC6和Ac-tubulin含量的改变,此外,又通过比色分析HDAC6活性的变化,采用免疫荧光标记和激光共聚焦技术观察细胞骨架结构的变化,来探究TCEP对自噬途径的影响。结果发现:(1)随着TCEP浓度增加,细胞活性逐渐下降。(2)与对照组相比,细胞中ROS水平、MDA含量以及SOD活性呈TCEP浓度依赖性上升,但SOD与MDA的相对比值则表现出TCEP浓度依赖性下降的趋势。(3)与对照组相比,随着TCEP浓度的增加,线粒体内ROS水平逐渐上升。(4)与对照组相比,加50 μMTCEP处理后,荧光显微镜下观察发现,发出红色荧光信号的细胞数量明显减少,提示线粒体膜电位下降;此外,线粒体膜上Ca2+-ATPase活性和Cytc氧化酶活性与对照组相比均显著性下降(P<0.01, P<0.05)。(5)与对照组相比,50μμMTCEP处理组,抗凋亡因子Bcl-2蛋白含量显著减少(P<0.01),Caspase-9的活性片段增加,且活化的Caspase-3蛋白含量显著性增多(P<0.01)。(6)与对照组相比,50μM TCEP处理后,HDAC6的表达量没有明显改变。但是,HDAC6的活性显著下调(P<0.01),且HDAC6的去乙酰化底物tubulin的乙酰化修饰显著增加(P<0.01)。(7)利用激光共聚焦显微镜观察发现,对照组细胞中微管成厚束状分布,而50 μM TCEP处理后,胞内的微管密度减少且细胞微管网状结构瓦解。(8) VitE预处理能够阻止50 μM TCEP所引起的线粒体过氧化损伤,凋亡相关蛋白的变化,HDAC6活性的下调,tubulin乙酰化修饰上调以及微管结构的瓦解。以上结果表明:TCEP处理能够抑制N2a细胞活性并诱导线粒体内的ROS水平升高,引起线粒体过氧化损伤,进而激活细胞内源性凋亡通路。此外,损伤的线粒体主要经自噬通路清除,而TCEP能够降低HDAC6活性,导致微管网状结构瓦解,这些异常改变可能导致受损线粒体经自噬途径的降解异常。本研究为TCEP的神经细胞毒性研究提供了一定的实验依据。