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目的: 探讨BDNF基因转染大鼠骨髓基质细胞BDNFmRNA、BDNF蛋白表达情况以及转染基因对其分化的影响。评价对大鼠骨髓基质细胞进行BDNF基因转染的可行性。
方法:
1、细胞培养：采用密度梯度离心法分离出大鼠BMSCs，在DMEM培养基中传代培养扩增；
2、细胞分组：将第三代BMSCs以1×106个/L的密度接种到6孔板。在细胞生长至80％融合时，随机分成未转染组、空载体转染组、BDNF转染组，每组4孔。
3、基因转染：BDNF转染组按标准方法以2μg PcDNA3.1-BDNF:6μl阳离子聚合物转染细胞；空载体转染组以2μg PcDNA3.1:6μl阳离子聚台物转染细胞；未转染组继续在原培养条件下培养。
4、BDNF蛋白表达测定：转染后24h，进行BDNF免疫细胞化学染色，光学显微镜计数BDNF染色阳性细胞数，结果用均数±标准差表示。
5、BDNFmRNA表达检测：转染后24h，各组BMSCs利用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)检测BDNF mRNA的表达。
6、BDNF蛋白表达时效性测定：分别在转染后1、3、5、7、9、11、13、15d收集培养液上清，利用ELISA检测培养液上清中BDNF蛋白含量。
7、BMSCs分化鉴定：转染后15d，进行NSE和GFAP免疫细胞化学染色，光学显微镜计数NSE和GFAP染色阳性细胞数，结果用均数±标准差表示。
8、统计学分析数据。
结果: 采用密度梯度离心法成功分离出BMSCs，并在体外大量扩增培养；转染后24h，BDNF转染组有大量BDNF染色阳性细胞，未转染组和空载体转染组BDNF染色阳性细胞极少，与BDNF转染组比较差异有统计学意义(P<0.01)。未转染组和空载体转染组间差异无统计学意义(P>0.05)：三组细胞RT-PCR均扩增出了约780bp的基因片段，条带光密度BDNF转染组高于未转染组和空载体转染组(P<0.01)，未转染组和空载体转染组间差异无统计学意义(P>0.05)；BDNF转染组在转染1d后BDNF蛋白即开始表达，5～9d升高趋势明显，11～15d升高趋势减缓，但BDNF蛋白表达量能够维持在较高水平。未转染组和空载体转染组也表现出随着时间变化，BDNF蛋白表达量升高趋势。但在各时间点BDNF蛋白表达量均明显低于BDNF转染组(配对t检验，P<0.01)。未转染组和空载体转染组间差异无统计学意义(P>0.05)；转染15d后，BDNF转染组有大量NSE和GFAP染色阳性细胞，未转染组和空载体转染组NSE和GFAP染色阳性细胞极少，与BDNF转染组比较差异有统计学意义(P<0.01)。未转染组和空载体转染组间差异无统计学意义(P>0.05)。
结论: 阳离子聚合物可以介导BDNF基因转染到体外培养的BMSCs中；BDNF基因转染BMSCs可以在较长时间内高效表达BDNF蛋白；对大鼠BMSCs进行BDNF基因转染具有可行性。