呼吸道感染是临床常见的疾病,70%-80%的急性上呼吸道感染由病毒引起。临床常见的呼吸道病毒种类多,且临床表现相似,根据临床症状难以进行病原学鉴别诊断。因此,有必要建立准确、低成本且快速的实验技术,为临床提供明确、全面、快速的病原学诊断,协助临床医生合理用药,减少抗生素的滥用。此外,新型呼吸道病毒可能像SARS冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)·一样,不仅会引起严重的传染性疾病,还会严重危及公共卫生安全。由呼吸道传播的传染病难以防控,容易在大范围内迅速传播,因此构建重大传染病监测平台,以实时监测发热呼吸道症候群(Febrile respiratory syndrome, FRS)病原谱的构成,及时发现重大传染病和新发传染病,对重大传染病及新发传染病的预防预警有着极为重要的意义。发热呼吸道症候群监测平台是目前国家重点建立的监测平台之一,其中涵盖的呼吸道病原体主要有甲型流感病毒(Influenza virus A, IFA)及其亚型H3N2/H1N1-09、乙型流感病毒(Influenza virus B, IFB)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)A/B亚型、副流感病毒(Parainfluenza virus, PIV) 1-4型、人鼻病毒(Human Rhinovirus, HRV)、腺病毒(Adenovirus, ADV)、人类冠状病毒(Human coronavirus, HCoV) 229E/OC43/NL63/HKU1、人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)、人偏肺病毒(Human Metapneumovirus, hMP V)共18种(型／亚型)呼吸道病毒,以及肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia, MP)。因此,常见呼吸道病毒感染的快速鉴别诊断及发热呼吸道症候群监测平台的建立均需要一种快速简便的方法,以检测多种呼吸道病原体。然而,目前单一反应条件PCR方法费时费力,而呼吸道病毒液相悬浮芯片(Respiratory virus panel fast array, RVP Fast)试剂盒昂贵,很难在国内临床实践中推广。为解决以上弊端,我们根据文献报道的引物和探针,成功建立了检测18种(型／亚型)呼吸道病毒的两种反应实时荧光定量PCR (real-time PCR),不仅可以辅助临床快速鉴别常见呼吸道病毒及其亚型,而且为发热呼吸道症候群监测平台的建立及其在流行病学调查等方面的应用提供了有利的技术支持。在上述所述的病毒中,本研究还尤其关注了作为FRS监测平台的病原谱之一的人类冠状病毒(HCoV),虽然该病毒因过去多引起普通感冒而不被重视。1965年、1967年先后被分离的人类冠状病毒HCoV-229E及HCoV-OC43,仅引起人类普通感冒。其后,又先后发现HCoV-NL63和HCoV-HKU1,可引起老年患者或免疫功能低下患者出现严重下呼吸道感染,甚至死亡。为调查229E、OC43. NL63、HKU1的流行情况,我们通过本实验室建立的real-time PCR检钡229E、 OC43、NL63、HKU1,分析2011年11月-2014年12月广州市FRS患者中229E、 OC43、NL63、HKU1的流行特征及其临床特征。除229E、OC43、NL63、HKU1之外,两种新型冠状病毒,即SARS-CoV以及中东呼吸综合征冠状病毒(Middle east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV),也引起了我们的关注。2002-2003年SARS-CoV在全球肆虐,引起人严重急性呼吸综合征,致死率高达10%。2012年出现的MERS-CoV,其感染患者的临床症状与SARS患者很相似,致死率高达50%以上。SARS-CoV与MERS-CoV的出现,彻底打破以往“冠状病毒仅引起轻微呼吸道症状”的观念,使冠状病毒开始受到关注。有研究表明,SARS-CoV与蝙蝠冠状病毒HKU3密切相关,MERS-CoV则与蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5密切相关,二者均可能由蝙蝠跨物种传播给人类。这些由动物冠状病毒变异而来的新型冠状病毒易造成新发传染病大范围流行,是目前科学家极其警惕并重点关注的研究对象。一方面,由于冠状病毒变异速度快,病毒亚型种类多,由动物冠状病毒变异而来的新型冠状病毒可传播人类,而且特异性PCR无法检测广谱冠状病毒,因此一种广谱筛查冠状病毒的通用型PCR方法是目前监测新型冠状病毒在人群中分布的首要选择。另一方面,由于病因病原不明,由SARS-CoV引起的非典型肺炎影响防治,从而导致大规模暴发,这一公共卫生事件一直警示人们需重视不明原因肺炎(Unexplained Pneumonia, UP)。因此,监测不明原因肺炎患者中新型冠状病毒,比在人群中大范围筛查新型冠状病毒更有意义,也更节约成本,有助于临床及时诊断和治疗。鉴于以上原因,根据冠状病毒RNA依赖RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase gene, RdRp)序列的高度保守性,由中科院武汉病毒研究所提供冠状病毒RdRp基因的引物序列,及本实验室前期经优化建立的冠状病毒通用型巢式PCR方法筛查广谱冠状病毒,我们对2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠状病毒进行调查,为预防预警重大传染病及可能出现的新发传染病做好应对准备。由于SARS-CoV至今没有再出现,针对SARS-CoV的研究也逐渐减少,目前尚缺乏针对患者体内SARS-CoV特异性抗体水平变化趋势的研究。另外,由于SARS-CoV核衣壳蛋白(SARS-NP)是目前作为SARS免疫诊断的理想靶抗原,本实验室前期基于原核表达SARS-NP的间接ELISA检测的血清学研究证实了这一点。为进一步优化SARS-NP间接ELISA方法,并以其作为应对SARS再次流行的储备诊断方法,我们建立了基于杆状病毒-昆虫系统表达SARS-NP的间接ELISA法检测SARS-NP特异性抗体,以研究SARS患者10年前后血清中SARS-NP抗体水平的变化趋势。本研究分为三部分：一、检测18种(型/亚型)呼吸道病毒的两种反应实时荧光定量PCR的建立临床常见的呼吸道病毒种类众多,感染的临床表现相似,根据临床症状难以进行病原学鉴别诊断。根据文献报道的引物和探针,成功建立了2种不同反应条件实时荧光定量PCR方法检测18种(型/亚型)呼吸道病毒。通过验证该法的敏感性和特异性、准确性,结果显示,该法的最低检测限为10拷贝数/gL,变异系数(CV)为1.27%～3.44%,且特异性良好。经检测408份呼吸道标本,鼻拭子检测的阳性率为63.2%(225/356),肺泡灌洗液检测的阳性率为25%(13/52)。说明建立的real-time PCR法简便、特异、灵敏、稳定。二、2011-2014年广州市4种常见冠状病毒的流行病学调查及2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠状病毒的调查通过上述的Real-time PCR方法检测18种(型/亚型)呼吸道病毒,分析2011-2014年广州市发热呼吸道症候群患者中229E, OC43、NL63、HKU1的流行病学情况。结果表明,4种冠状病毒的总检出率为4.42%(104/2355),HCoV合并HRV (17.3%,18/104)及HCoV合并RSV(14.4%,15/104)感染最常见；不同年龄组(P=0.188>0.05)、不同来源标本(P=1.000>0.05)中4种常见人类冠状病毒的检出率无明显差异。2011年11月-2014年12月HCoVs流行情况大致为HCoVs各季节均有分布；其中OC43和NL63主要分布于2012年和2014年,呈两年一次高峰期的典型特征,OC43各季节均有分布,但NL63主要集中于夏秋季(6-10月)；229E与HKU1呈散在分布。HCoV感染患者最常见的临床症状为发热。大部分(66.3%)患者出现了下呼吸道感染,甚至出现重症肺炎(6.73%)及死亡病例(1.92%),说明HCoV感染不仅引起轻型呼吸道症状,还会引发严重疾病。此外,我们还通过通用型巢式PCR及基因测序,对2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠状病毒进行调查,以筛查出新型冠状病毒。结果显示,不明原因肺炎患者272份呼吸道标本(鼻拭子标本数n=204,肺泡灌洗液n=68)中,均无检测出新型冠状病毒。然而,由于重症肺炎及死亡病例在不明原因肺炎中分别占9.93%(27/272)和3.68%(10/272),提示UP可引发严重疾病。三、10年前后SARS患者核衣壳蛋白抗体效价变化的血清学研究以实验室前期Bac-to-Bac杆状病毒系统表达的重组SARS-NP作为抗原,进一步优化建立间接ELISA法,检测10年前后SARS患者恢复期血清中SARS-NP特异性IgG,分析SARS-NP IgG水平变化情况。实验表明,基于杆状病毒表达的间接ELISA法与其它病原体无交叉反应。532份体检者血清中,间接ELISA检出率为1.13%(6/532),经Western blot确证阳性率为0.75%(4/532)。该法的假阳性率为0.38%,特异性为99.62%。同时测定了13名SARS患者10年前后的血清,总检出率为95%(57/60,n=60,n表示13名SARS患者10年前、后的总血清标本数),即敏感度为95%； 10年前的血清检出率为98.2%(54/55,n=55,n表示13名SARS患者10年前的血清标本数)；10年后的血清(n=5,n表示上述其中5名SARS患者10年后的血清标本数)中,仅3份检测为阳性。此外,5名SARS患者10年前SARS-NP IgG最高效价由1：160到1：5120不等,10年后SARS-NP IgG最高效价由1：10-1：160不等。10年前后SARS患者体内SARS-NP IgG水平呈明显的下降趋势,但部分患者SARS-NP IgG抗体效价仍很高,说明SARS-NP IgG可长期存在于患者体内。小结综上所述,本研究的必要性及意义如下：1.本研究成功建立了检测18种(型／亚型)呼吸道病毒的两种反应的real-time PCR并进行了临床标本评估。本方法简便,涵盖的病毒种类多,成本低,且具有临床应用价值,并为发热呼吸道症候群监测平台的建立及其在流行病学中的应用提供了有力的技术支持。2.分析发热呼吸道症候群患者中229E、OC43、NL63、HKU1的流行病学特征及临床特征,对不明原因肺炎患者中新型冠状病毒及临床特征进行调查,实时监测呼吸道病原体的构成及流行特征,对预防预警重大传染病及新发传染病的发生发展有重要的意义。3.建立基于杆状病毒表达重组SARS-NP的间接ELISA法检测SARS-NP特异性抗体,调查SARS患者10年前后血清中SARS-NP抗体水平的变化趋势以及体检者血清中SARS-NP抗体的检出情况。该法既可作为应对SARS再次流行的储备诊断方法,还可用于血清学研究观察抗体水平变化,有助于进一步了解机体对SARS的体液防御机制。