绵羊MHC 222G18 BAC克隆基因筛选和绵羊MHC已知基因的克隆与原核表达

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yinxiaomei
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目的:绵羊主要组织相容性复合体(MHC)是与绵羊各种抗原递呈、免疫调节、抗性/易感性等紧密相关的基因簇,这些基因是一组紧密连锁的基因群。目前我们对绵羊MHC的基因组结构信息知之甚少。开展绵羊基因组MHC区段基因结构与组成的研究旨在寻找并研究与重要经济性状紧密相关的基因以及与绵羊对疾病的抗性或易感性相关的基因,并用于指导遗传育种。本研究的目标是利用本实验室构建的中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库和高密度物理图谱,筛选出中国美利奴细毛羊MHCclassII区222G18BAC克隆内的表达基因,分析绵羊222G18 BAC克隆的基因结构。同时,对绵羊MHC区段已知基因进行克隆与原核表达,为相应基因功能的研究奠定基础。  方法:对MHC区段阳性克隆222G18,用BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,通过噬菌斑原位杂交技术筛选中国美利奴绵羊五种组织cDNA混合文库,筛选出该BAC克隆插入片段中可表达基因。同时,利用GenBank数据库中已有的绵羊、牛MHC基因的EST序列以及杂交筛选获得的序列,进行序列分析。对部分MHC全序列基因设计特异性引物,PCR克隆并进行原核表达,并对表达出的蛋白质进行初步分析。  结果:经过两轮杂交筛选,获得12个cDNA阳性克隆,经测序、比对等生物信息学分析确定获得7条与免疫相关的序列,其中3条具有完整的编码序列。利用SIM4软件将7条序列定位到BAC克隆上,结果显示绵羊MHC区段的表达序列多为断裂基因且跨度很大。同时,对绵羊MHC的MHCI、DRA、DRB1、DQB1、DQA1和DQA2这6个已知基因进行了特异PCR克隆。对DQA1和DRB1进行原核表达,表达的蛋白质大小分别为28KDa和30KDa。  结论:绵羊MHC区段BAC阳性克隆222G18的杂交筛选共得到7个基因,其中3个具有完整编码序列,分别编码绵羊MHC区段DRA、DRB1和BTNL2基因的完整序列。基因DRA与绵羊细菌性腐蹄病相关,基因DRB1与绵羊胃肠道线虫病和淋巴瘤相关,基因BTNL2与结节病和包涵体皮肌炎等疾病发病相关,其它的基因也与绵羊的免疫相关。从绵羊cDNA文库中克隆得到的6个基因分别编码绵羊I类分子和II类分子。MHCI编码I类分子的α链,它主要参与内源抗原肽的清除。DRA、DQA1、DQA2编码II类分子的α链;DQB1、DRB1编码II类分子的β链,它们主要参与外源抗原肽的清除。
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