细胞色素P450 2C9(CYP2C9)是人体内重要的Ⅰ相药物代谢酶,参与了超过15%临床药物的代谢清除。CYP2C9基因具有高度的多态性,目前已发现60种CYP2C9突变体。这些基因多态性可能影响其底物药的代谢清除速率,并导致血浓度的改变,进而引发药物不良反应。故研究CYP2C9基因多态性对临床安全用药、药物不良反应的预测及指导合理用药具有重要的意义。本论文通过meta分析发现,CYP2C9基因多态性对其底物苯妥英维持剂量具有显著影响。但上述研究同时发现,目前研究的突变体主要为CYP2C9*2和*3,而150位精氨酸的突变在非裔美国人(CYP2C9*8)和中国人(CYP2C9*27)中出现的频率均高于这两个人群中CYP2C9*2的突变频率。为进一步研究CYP2C9第150位突变,本研究构建了稳定表达CYP2C9*8和*27的HKE293T细胞株,并通过体外酶活性实验,分析了CYP2C9*8和*27对其底物代谢活性的影响。本研究发现第150位的突变可能影响CYP2C9与P450氧化还原酶(P450oxidoreductase,POR)的相互作用。本研究又构建了 POR的表达体系,为进一步分析150位突变如何影响CYP2C9与其辅酶的相互作用提供有力工具。论文主要内容包括如下三个部分。第一部分亚洲癫痫患者中CYP2C9/2C19基因多态性与苯妥英维持量的相关性的meta分析目的CYP2C9基因多态性可能影响其底物药物的药代动力学行为,并可能影响药物的安全性。苯妥英是抗癫痫的一线药物,其治疗窗窄,且疗效具有明显的个体差异。CYP2C9是催化苯妥英代谢清除的主要代谢酶(90%),此外CYP2C19对苯妥英的代谢清除也有少量贡献(约10%)。本研究旨在通过meta分析探讨亚洲癫痫患者人群中CYP2C9和CYP2C19基因多态性对苯妥英维持剂量的影响。方法系统检索了 PubMed以及EMBASE数据库,查阅2017年6月14日之前的相关发表文献。采用RevMan 5.2.3分析CYP2C9/2C19酶基因多态性与苯妥英每日维持剂量的相关性。结果包含993例患者的6篇文献符合纳入标准并纳入meta分析中。结果显示,携带CYP2C9突变体的患者需要PHT剂量调整,仅有一个野生型CYP2C9等位基因的患者PHT的维持剂量推荐下调22%。此外,在CYP2C9野生型的患者中,携带CYP2C19*1/*2或者CYP2C19*1/*3的患者不需要剂量调整,但携带CYP2C19*2/*2,CYP2C19*2/*3或者CYP2C19*3/*3的患者PHT维持剂量应当下降11%。。结论研究结果显示,具有CYP2C9/2C19突变的患者需要降低苯妥英维持剂量。由于不同人群的基因多态性存在差异,人群差异也是影响苯妥英维持剂量的原因之一。此外,本部分研究中发现,目前CYP2C9基因型对药物代谢的影响的研究集中在CYP2C9*2和CYP2C9*3两个突变,而在亚洲人群中,包括CYP2C9的150位精氨酸突变在内的其他突变对药物的代谢的影响及其机制研究尚不足。第二部分细胞色素P450 2C9*8和*27的表达及活性研究目的本研究的第一部分发现,目前研究最多的是CYP2C9*2和CYP2C9*3两个突变。但是CYP2C9第150位氨基酸突变在亚洲人群CYP2C9*27(499G>T)和非裔美国人CYP2C9*8(449G>A)中的频率均高于CYP2C9*2。本部分拟构建慢病毒表达质粒,将人细胞色素P4502C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8和CYP2C9*27稳定表达于人HEK293T细胞。并使用该表达体系获得的CYP2C9突变体,结合过氧化氢异丙苯绕过POR供电,考察代谢能力的变化,探讨第150位精氨酸改变CYP2C9代谢活性的机制。方法反转录人肝组织总RNA获得cDNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,将其克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G>A和449G>T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8和MigR1-CYP2C9*27慢病毒表达质粒。在HEK 293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8和 CYP2C9*27 的细胞,命名为 293T-2C9、293T-2C9*8 和 293T-2C9*27。实时定量 PCR(qRT-PCR)和Western blot检测胞内CYP2C9表达。采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸,结合过氧化氢异丙苯,考察突变体对CYP2C9突变体是否影响其活性及与POR的相互作用。结果成功构 MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8 建和 MigR1-CYP2C9*27 表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9*8和293T-2C9*27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR和western blot均表明有目标分子表达。提取这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸。在NADPH存在,通过POR传递电子的情况下,CYP2C9*8的代谢能力低于CYP2C9*1。当使用过氧化氢异丙苯绕过POR提供电子时,CYP2C9*1与CYP2C9*8微粒体催化双氯芬酸生成4-羟基双氯芬酸并无显著性差异结论成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8和CYP2C9*27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8和*27两个突变体的功能研究。CYP2C9*8下调酶活性的机制可能与突变影响POR相互作用相关。第三部分细胞色素P450还原酶的表达及对CYP2C9第150位精氨酸突变的代谢影响目的第二部分研究发现,CYP2C9第150位单核苷酸突变可能影响其与辅酶的相互作用,为进一步分析150位突变对CYP2C9与其辅酶相互作用的影响,本部分构建CYPs的氧化还原搭档POR的慢病毒表达载体,在HEK239T细胞中的稳定表达,并探索POR对CYP2C9第150位精氨酸突变体代谢活性的影响。方法反转录人肝组织总RNA获得cDNA,PCR扩增获得POR编码序列,将其克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-POR。在HEK293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达POR的细胞,命名为293T-POR。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测胞内POR表达。在体外酶活性实验中,比较添加POR对CYP2C9野生型及突变体代谢双氯芬酸的酶活性的影响差异。结果成功构建MigR1-POR表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-POR在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR和western blot均表明有目标分子表达。向野生型CYP2C9中添加POR对其代谢活性无显著影响,但POR导致CYP2C9*8的活性下降。结论成功构建稳定表达POR人源化细胞模型,添加POR对CYP2C9*8活性的影响较对野生型CYP2C9的影响强。