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目的:Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是病原相关分子模式识别受体,与相应配体结合后激活其下游信号转导途径,诱导炎症反应和天然免疫应答,同时促进抗原提呈细胞的活化并介导获得性免疫反应,从而在宿主抗微生物感染中发挥重要作用。TLR3是病毒双链RNA识别受体,活化后能激活NF-κB和IRF3途径来抵抗病毒感染。此外,TLR3活化后还能诱导细胞损伤,并破坏体内血管屏障引起病毒扩散,从而加速疾病的进程。本研究的目的是通过分析TLR3损伤的关键信号分子,尝试抑制此关键分子来干预TLR3诱导的细胞损伤,为临床选择相关靶点延缓感染性疾病的进程提供理论基础。方法:1、RT-PCR检测基因的表达。2、流式细胞术检测蛋白质的表达。3、Western blot检测信号转导分子的活化。4、PI/Annexin V染色检测细胞凋亡水平。5、抗体中和实验验证相关信号分子与细胞凋亡的相关性。6、构建真核表达载体pcDNA3.1+/ΔNp63α并转染内皮细胞,检测ΔNp63α对TLR3诱导细胞凋亡的影响。结果:RT-PCR结果显示人脐静脉内皮细胞HUVEC较高表达Toll样受体家族中的TLR2、3、4和5,低表达TLR6和9,不表达TLR1、7、8和10。作为对照人外周血单个核细胞表达所有TLR1-10基因。利用TLR3配体dsRNA的类似物PolyⅠ:C刺激HUVEC,结果显示PolyⅠ:C上调TLR3基因表达并呈剂量依赖性,FACS分析结果显示HUVEC细胞表达TLR3蛋白质。Western blot检测发现PolyⅠ:C作用TLR3诱导了其下游信号分子NF-κB的活化,并剂量依赖性地上调细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β的基因表达,表明HUVEC表达功能性的TLR3受体。此外,PolyⅠ:C处理的HUVEC细胞表现出与Staurosprine(一种凋亡诱导化学物质)处理后相似的形态学改变,PI/Annexin V染色显示PolyⅠ:C诱导了剂量相关的细胞凋亡;这种作用由TLR3所介导,因为TLR3的中和抗体能显著抑制PolyⅠ:C所诱导的细胞凋亡。PolyⅠ:C处理的HUVEC同时活化了caspase 8和9及其下游分子PARP,caspase和PARP抑制剂能显著抑制PolyⅠ:C诱导的凋亡,表明TLR3通过内源性途径(又称线粒体途径)和外源性途径(又称死亡受体途径)诱导细胞凋亡。由于我们同期的研究还发现TLR3诱导的细胞凋亡受p53家族成员TAp63α的调控,因此我们构建了TAp63α的显性负性异构体ΔNp63α的真核表达载体,转染HUVEC后显示其能显著抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。结论:HUVEC表达功能性的TLR3,活化的TLR3通过内、外源性两条途径诱导HUVEC细胞凋亡。TAp63α的显性负性突变异构体ΔNp63α降低PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡,推测TAp63α在TLR3诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。