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目的弗朗西斯菌属(Francisella)细菌是一种兼性细胞内寄生的革兰阴性菌球杆菌。该菌属模式菌种—土拉弗朗西斯菌,具有高度的致病能力和通过气溶胶传播的特性,被认为是一种潜在的生物恐怖细菌。其他的弗朗西斯菌种通常被认为是环境菌种、非致病菌或者机会性致病菌。近年来的研究发现,弗朗西斯菌广泛存在于自然界的淡水、咸水源和土壤中,其中人工供水系统中集中空调冷却水是一个新发现的生境。本研究旨在采用多相分类的方法,对分离自空调冷却水的弗朗西斯菌样细菌(SYSU 10HL1970、10HP457、10HL1938、10HP82-10、SYSU YG23)进行生理生化、化学和分子生物学鉴定,确定其分类地位,便于评估其毒力、致病性和通过集中空调系统传播疾病的能力。方法1.经典分类采用传统实验方法进行氧化酶、触酶实验和H2S还原实验等实验,以及采用API 20NH、API ZYM和Rapid ID 32A的试剂盒进行生化实验,E-test法检测抗生素敏感性。选择科内相近种的典型菌株F.philomiragia ATCC25015、F.guangzhouensis 08HL01032T作为参比菌株与供试菌株做平行实验,进行比较分析。2.化学分类采用薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱方法测定供试菌株的极性脂、呼吸醌、脂肪酸组分,选择科内相近种的典型菌株F.philomiragia ATCC25015、F.guangzhouensis 08HL01032T作为参比菌株与供试菌株做平行实验,以比较分析。3.分子分类采用高效液相色谱(基因组DNA G+C mol%含量分析)、蛋白质谱、PCR扩增和基因测序相结合的核酸分析、DNA-DNA杂交等技术对供试菌株进行分子分类。根据分子分类的结果,该五株菌分类为2个菌群,SYSU YG23T和SYSU10HL1970T分别被指定为模式菌株(Type strain)。结果1.经典分类sysuyg23t、sysu10hl1970t、10hp457、10hl1938、10hp82-10五个供试菌株符合弗朗西斯菌科细菌的基本特征,其均为革兰氏阴性球杆菌,氧化酶阴性、触酶弱阳性且l-半胱氨酸能促进其生长(chab培养基和嗜血杆菌巧克力培养基上菌落大于血平板)。具有与弗朗西斯菌科细菌类似的药敏特征:β-内酰酶试验阳性,对头孢菌素耐药,对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类抗生素敏感。总体生化特征类似于广州弗朗西斯菌,但存在一定差异,如蔗糖发酵、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、苯丙氨酸芳胺酶。2.化学分类sysuyg23t、sysu10hl1970t、10hp457、10hl1938和10hp82-10五个供试菌株的极性脂和醌组主要组分相同,主要含有磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,pe)、双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,dpg)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,pg)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,pc)、含氨基的未知磷脂(unidentifiedaminophospholipid,apl4,apl2)、未知磷脂(pl2,pl3和pl4)、未知糖脂(gl2)和少量的未知糖脂(gl1,gl3)。呼吸醌类型是q-8,主要脂肪酸成分是c10:0、c14:0、c16:0和两个长链羟基脂肪酸c18:1ω9c和c18:13-oh,但在脂肪酸含量和种类上与参考菌株稍有不同,而且sysuyg23t和其它四个供试菌株在主要脂肪酸含量上有所区别,且sysuyg23t和其它四个供试菌株在主要脂肪酸含量上有所区别。3.分子分类16srrna基因比对结果显示:sysu10hl1970t、10hl1938、10hp82-10和10hp457的相似度为100%,与sysuyg23t之间的相似度为98.6%;且两者与广州弗朗西斯菌08hl01032t的相似度最高,分别为98.87%和98.82%,但都与其他弗朗西斯菌种的相似度低于95.3%。以mp、nj和ml三种方法构建的16srrna基因系统发育树均显示:该5株菌与广州弗朗西斯菌位于一个大的分枝上,与广州弗朗西斯菌分别形成3个小枝,其中sysu10hl1970t、10hl1938、10hp82-10和10hp457形成一个进化枝,sysuyg23t单独为一个枝。管家基因mdh、rpob和sdha扩增成功,长度分别是700bp、300bp和300bp。基于单个管家基因及串联管家基因的系统发育树一致且与基于16srrna基因的系统发育树一致。即三个管家基因测序分析的结果亦表明,该五株可分为2个进化群,其分别与广州弗朗西斯菌亲缘关系密切,但又与广州弗朗西斯菌存在明显的差异。MALDI-TOF MS的分析结果显示,SYSU 10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457和存在特征的蛋白质谱峰5110m/z、6123m/z、9360m/z;SYSU YG23T存在特征的蛋白质谱峰5110m/z、4754m/z、6123m/z、9360m/z,且在4754m/z有峰,相对强度大于5110m/z峰相对强度。聚类分析显示,SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457形成一个聚类群,SYSU YG23T单独为一个聚类群。基于细菌全基因组的分析结果显示:SYSU 10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457四株菌之间的杂交率>80%,即该四株菌为同一个种;与SYSU YG23T的杂交率在低于70%,即该四株菌与SYSU YG23T分别属于两个不同的菌种。另外,该五株菌与已知亲缘关系接近的广州弗朗西斯菌08HL01032T和蜃楼弗朗西斯菌也低于70%,亦支持其新属新种的分类地位。该两个新属新种的G+C mol%含量分别为:SYSU 10HL1970T的G+C mol%含量为30.0%,SYSU YG23T的G+C mol%含量为32.6%。结论根据经典分类、化学分类和分子分类的试验结果,SYSU 10HL1970T(=KCTC42969=DSM 101835)、10HL1938、10HP82-10、10HP457四株菌和SYSU YG23T(=KCTC 42968=DSM 101834)为弗朗西斯菌科的两个新属新种。根据细菌新种的命名法则,分别命名为冷却水另弗朗西斯菌(Allofrancisella frigidaquae)和意外另弗朗西斯菌(Allofrancisella inopinata)。另外,广州弗朗西斯菌08HL01032T(F.guangzhouensi)与其他弗朗西斯菌种存在差异,但与两个新属新种存在有许多共同点,所以将广州弗朗西斯菌重新划分入另弗朗西斯菌属内,命名为广州另弗朗西斯菌(Allofrancisella guangzhouensis)。