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对苯二甲酸二甲酯（DMT）广泛用于聚酯和工业塑料生产,如作为聚对苯二甲酸二乙酯（PET）、聚对苯二甲酸二丁酯和聚对苯二甲酸丙二醇酯的生产原料,并且也是PET塑料瓶回收解聚过程中的主要产物。随着塑料产品的大量生产及使用,包括DMT在内的塑料添加剂被广泛释放到土壤、海洋等环境中。DMT被报道会导致人类癌症和慢性肾脏发炎,也会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。环境中DMT残留的消除问题日益受到人们关注。有研究表明微生物在DMT的降解中起着关键作用,目前一些DMT降解菌株已被分离鉴定,并且这些菌株的降解特性及降解途径也被研究清楚,然而关于DMT降解的关键酶基因却鲜有报道,对DMT及其降解产物的生物学毒性研究十分匮乏。因此,本论文筛选分离了新的DMT降解菌株,研究了其对DMT的降解特性和降解途径,并克隆关键的降解基因并研究其酶学特性,最后比较了 DMT与其降解产物的毒性差异,明确了 DMT脱甲基的生物降解意义,本研究取得的主要结果如下:1.对苯二甲酸二甲酯和对苯二甲酸单甲酯降解菌的分离鉴定及其降解特性通过富集培养的方法从江苏建湖一处长期覆盖地膜的田间土壤中分离到一株可以降解DMT的菌株,通过菌株生理生化性质及16S rRNA基因系统进化树分析,将其鉴定命名为Sphingobium sp.C3。菌株C3可在7 d内将0.2 mM的DMT降解85.9%,过程中只生成一种产物,经HPLC-MS/MS鉴定,该产物为对苯二甲酸单甲酯（MMT）。菌株的降解特性试验表明菌株C3不能利用DMT为唯一碳源或能源生长,菌株C3降解DMT的最适温度为30℃,最适pH为8.0,此外当DMT浓度在0.05-0.30mM之间时,底物浓度的增加可以提高降解速率,但最终DMT不能被完全降解,推测可能是由于产物抑制作用。接着又通过富集培养的方法从江苏射阳一处长期受塑料垃圾污染的海滩土壤分离到一株可以降解MMT的降解菌,通过菌株生理生化性质及16S rRNA基因系统进化树分析,将其鉴定命名为Stappia sp.B0-1。菌株B0-1可在9d内将0.2mM的MMT完全降解,全部生成对苯二甲酸。菌株的降解特性试验表明菌株B0-1不能利用MMT为唯一碳源或能源进行生长,降解MMT的最适温度为37℃,最适pH为6.0,MMT起始浓度在0.05-0.40 mM之间时,底物浓度越高,降解效率越低。2.DMT酯酶基因dmtH的克隆及序列分析根据代谢途径和相关文献报道,通过生物信息学分析比对的方法从菌株C3的基因组中找到三个潜在的酯酶基因,通过异源表达验证成功克隆到了催化DMT水解成MMT的关键酶基因dmtH,基因dmtH包含891 bp,其编码的酯酶包含296个氨基酸。酯酶DmtH属于酯酶第V家族,在UniProtKB/Swiss-Prot数据库与Mycobacterium tuberculosis CDC1551中的烯酸酯水解酶具有最高同源性,为40.64%,DmtH还具有α/β水解酶超家族典型的三联体催化位点Ser-Asp-His/Glu和特征序列标签GXSXG。3.酯酶DmtH的表达、纯化及酶学特性通过异源表达纯化获得了重组酯酶DmtH,酶促反应表明酯酶DmtH可以催化DMT断一个甲酯键生成MMT,与菌株的降解途径一致,此外酯酶DmtH还可以催化断裂间苯二甲酸二甲酯、对苯二甲酸二乙酯、对苯二甲酸二烯丙酯、精恶唑禾草灵和精喹禾灵的酯键。酶学特性试验表明DmtH的最适反应温度为30℃,在50℃孵育60 min时还可以保留40%左右的活性,在低于30℃下孵育60min,可以保留80%以上的酶活力。在pH 7.5-9.0之间可以保留60%的相对酶活性且最适反应pH为7.6。Ca2+、Co2+、Cr3+、Cd2+、Cu2+和 Mn2+（1 mM）可以抑制 60%以上的酶活性,Fe3+、A13+、Zn2+、Ag+和Ni2+（1 mM）则抑制 40%左右的酶活力。Tween-20（5%）、Tween-80（5%）、CTAB（5%）、SDS（10mM）和 PMSF（10mM）可以抑制 80%以上的酶活力。4.DMT和MMT的生物学毒性比较以模式动物秀丽线虫为研究对象,比较了 DMT和MMT对于线虫的生物毒性差异,结果表明DMT可以显著诱导肠道ROS产生、运动行为衰减以及寿命缩短,而MMT则没有明显毒性效应。DMT还可以显著诱导线虫体内氧化应激反应,MMT则不会诱导氧化应激反应。最后,DMT还可以诱导线虫体内线粒体未折叠蛋白反应,并且对其关键基因atfs-1进行RNAi后,DMT对线虫的毒效应更加强烈,表明线虫通过线粒体未折叠蛋白反应帮助线虫应对DMT的毒性胁迫。生物学毒性数据显示,DMT被降解为MMT后生物学毒性显著降低,表明DMT转化为MMT具有生物降解意义。总之,本研究分离到两株可以分步降解DMT的菌株C3和B0-1,丰富了 DMT微生物降解的菌种资源。从菌株C3中成功克隆到催化DMT起始降解的关键酯酶基因dmtH并研究了其酶学性质,最后比较了 DMT和MMT的生物学毒性差异,发现DMT被转化为MMT之后生物学毒性显著降低,进一步增强了生物降解的意义。