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目的内皮细胞(endothelial cell)作为血管壁的组成部分,参与血管功能的调节。动物机体微血管极其丰富,其内壁所覆盖的内皮细胞所占有面积约为大血管内皮细胞总和的50倍。因此,微血管内皮细胞异常会对血管系统功能产生巨大影响。本实验以人肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMEC)作为研究对象,观察模拟微重力效应对人PMEC的影响;分析模拟微重力效应下人PMEC的miRNA表达谱,验证差异表达的miRNAs;并对差异表达最显著的miR-503-5p在微重力条件下对人PMEC的作用及其机制展开研究;最后通过大动物(比格犬)实验确认模拟微重力效应对犬PMEC的影响以及对犬血压和心电图的影响,旨在从分子、细胞和整体动物水平,研究模拟微重力效应对微血管内皮细胞的影响,揭示模拟微重力环境下的心血管效应,为航天飞行安全提供实验依据。方法以人PMECs为模型,采用旋转培养器旋转培养72小时模拟微重力效应。采用Annexin-V Fluoresceine Isothiocyanate(FITC)和Propidium Iodide(PI)双染法检测细胞凋亡情况,采用JC-1荧光探针法检测模拟微重力效应对细胞线粒体膜电位的影响,采用Caspase-Glo?3/7试剂盒检测凋亡执行因子Caspase 3/7活性。并通过透射电镜检测模拟微重力效应对人PMEC超微结构的影响。通过Agilent human miRNA(8*60K)V19.0芯片分析模拟微重力条件下人PMEC miRNAs的表达谱,并通过实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证miRNAs的差异表达。采用TargetScan 7.1、TarBase v7.0、miRDB 2016在线预测软件预测差异表达miRNAs的靶基因,通过在线软件GeneCoDis3分析靶基因所涉及的生物过程和信号通路。通过采用HiPerFect Transfection Reagent将miR-503-5p模拟物(miR-503-5p mimic)和抑制剂(LNA-antimiR-503-5p)转染到细胞以高表达或沉默miR-503-5p。采用qRT-PCR和Western blot分析miR-503-5p靶基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达情况以及靶基因IGF-1R和AKT(总AKT和磷酸化AKT)蛋白的表达情况。以比格犬为实验动物,穿戴马甲尾吊7天模拟微重力效应。第8天解剖2只尾吊组动物和2只正常重力对照组动物,取肺组织用于透射电镜检查。同时,剩余动物解除尾吊进入恢复期。实验期间称量动物体重和摄食量,采用血球仪和全自动生化分析仪分别检测动物血液学和血清生化指标,并通过透射电镜观察尾吊模拟微重力对犬PMEC的影响,通过DSI遥测系统检测动物血压和心电图的改变情况。结果旋转培养模拟微重力效应72小时后,人PMEC凋亡率显著高于正常对照组(P<0.01),线粒体膜电位出现显著下降(P<0.05),Caspase 3/7的活性显著升高(P<0.01)。细胞透射电镜观察结果显示,旋转培养72小时后细胞出现典型的凋亡改变特征,包括染色质边集、线粒体出现破坏、凋亡小体形成。按筛选标准(改变倍数>2,P值<0.05,且Flag值/Call值显示为P),芯片分析共筛选出8个差异表达的miRNAs,其中miR-503-5p、miR-424-5p、miR-4485、miR-630、miR-5703和miR-937-5p表达上调(与对照组相比,上调倍数分别为6.92、2.07、2.28、3.08、2.41和2.44),miR-1973和miR-4430表达下调(与对照组相比,下调倍数分别为0.39和0.48)。qRT-PCR验证结果与芯片结果一致。miR-503-5p为表达上调最显著的miRNA。通过软件预测,这些差异表达miRNAs共涉及9186个靶基因,主要涉及DNA依赖性转录调控、信号转导、多细胞脏器发育、跨膜转运、细胞凋亡过程、从RNA聚合酶II转录调控启动子区转录的正向调控、离子运输、细胞粘附等生物过程,并涉及癌症信号通路,MAPK信号通路、局部粘附、细胞因子-受体相互作用、内吞、肌动蛋白细胞骨架调控、神经活性配体-受体相互作用、趋化因子信号转导通路、Wnt信号通路、钙信号通路等。在正常重力条件下,miR-503-5p mimic(模拟物)转染人PMEC后,细胞凋亡率显著高于miR-503-5p mimic NC组(阴性对照组)(P<0.01)和仅培养基对照组(Control组)(P<0.01)。在转旋培养模拟微重力效应72小时后,miR-503-5p mimic组细胞凋亡率显著高于miR-503-5p mimic NC组(P<0.01)和仅进行旋转培养组(P<0.01)。在转旋培养72小时后,LNA-miR-503-5p(miR-503-5p抑制剂)组细胞凋亡率显著低于LNAmiR-503-5p-NC(阴性对照)组(P<0.01)和仅进行旋转培养组(P<0.01)。旋转培养72小时后(miR-503-5p高表达),人PMEC中Bcl-2 mRNA和蛋白表达低于正常重力对照组细胞(P<0.01)。而在转旋培养72小时后,LNA-miR-503-5p组(miR-503-5p沉默)Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平均显著高于LNA-miR-503-5p-NC组(P<0.05和P<0.01)和仅进行旋转培养组(P<0.01)。另外,Western blot分析结果还显示,旋转培养72小时后,人PMEC中IGF-1R和pAKT蛋白的表达量均低于正常重力对照组细胞(P<0.01)。而在转旋培养72小时后,LNA-miR-503-5p转染组细胞中IGF-1R和pAKT蛋白表达水平高于LNA-miR-503-5p-NC转染组细胞(P<0.01和P<0.05)和仅进行旋转培养组细胞(P<0.01)。与尾吊前相比,比格犬自尾吊第3天开始体重出现略微下降,至第7天下降最为明显,停止尾吊后动物体重逐渐恢复。动物摄食量下降要早于体重改变,其中第3天摄食下降作为明显,第7天起摄食量逐渐恢复,解除尾吊后摄食量恢复至对照组水平。尾吊对动物血液学和血清生化指标无显著影响。尾吊7天后,犬肺微血管内皮可见凋亡早期改变,包括内皮肿胀,核内染色质边集,并可见线粒体肿胀。同时,在尾吊早期阶段(第1天内)可致动物血压(收缩压、舒张压和平均动脉压)升高和心率加快,第3天起尽管无统计学差异,但仍可见尾吊组动物血压低于正常重力对照组。在去除尾吊0.5小时后可见动物收缩压、舒张压、平均动脉压出现一过性下降,尽管与正常重力对照相比无统计学差异,但其下降程度明显,同时可见心率略有升高趋势。该现象于去除尾吊后约1-2小时即恢复。结论在模拟微重力效应下,离体人PMEC可出现凋亡改变。该过程中涉及多个miRNAs的差异表达,其中miR-503-5p上调最为显著,在该过程中起到关键作用;其机制可能涉及对靶基因Bcl-2表达的调控以及IGF-1R/AKT信号通路的调节。尾吊7天模拟微重力效应可导致比格犬PMEC损伤,主要表现为凋亡早期改变,包括内皮肿胀、核内染色质边集、线粒体肿胀。此外,尾吊3天可见比格犬血压、心率可出现明显升高,而随后血压出现轻微下降趋势;在去除尾吊后,动物出现短时的血压下降,并很快即可恢复。