昆虫几丁质脱乙酰基酶BmCDA1和OfCDA1的性质研究

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几丁质脱乙酰基酶属于糖酯酶4家族,能催化几丁质的乙酰氨基水解生成壳聚糖。昆虫几丁质脱乙酰基酶1(CDA1)主要在昆虫蜕皮过程的表皮中表达,很可能参与新表皮中几丁质的装配过程,因此具有重要的生理功能。  本研究主要内容包括:⑴利用PCR分别调取了家蚕和亚洲玉米螟中的BmCDA1和OfCDA1基因。BmC DA1和OfCDA1的开放阅读框分别为1620bp和1617bp。进化分析表明,BmCDA1和Of CDA1同属于昆虫GroupⅠ几丁质脱乙酰基酶,序列一致性高达96%,说明鳞翅目昆虫CDA1可能具有很高的保守性。与真菌及细菌来源的几丁质脱乙酰基酶一样,序列分析表明两者含有5个与催化相关的保守基序。⑵BmCDA1的基因转录水平研究表明,在不同组织中,BmCDA1在表皮中表达量最高;在不同发育过程中,BmCDA1在蛹期表达量明显升高。说明该酶主要存在于表皮中并且在化蛹时发挥重要功能。注射蜕皮激素12 h后BmCDA1表达量发生上调,说明该基因的表达受蜕皮激素的调控。⑶选择不同的表达系统对不同来源的CDA进行重组表达。在大肠杆菌中,BmCDA1以包涵体形式表达,未能实现分离纯化;在毕赤酵母中,BmCDA1和Of CDA1能够表达,甲醇诱导144h后,可以通过硫酸铵沉淀和金属螯合层析两步从发酵液上清中纯化获得重组蛋白。⑷采用荧光胺法和3-甲基-2-苯并噻唑酮腙法对重组表达的CDA活性进行检测,结果表明:BmCDA1没有检测出酶活性。但几丁质结合实验发现,BmCDA1具有结合胶体几丁质的能力。
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