研究背景癫痫是神经系统常见的急症、重症之一,全球有数千万的癫痫病人,反复的癫痫发作给个人、家庭、社会带来沉重的经济和心理负担。近年来,癫痫的病因、发病机制、病理和治疗等许多方面的研究已经取得了很大进展,但癫痫发作具体发病机制尚未完全阐明,每次癫痫发作起始与终止的内在机制具体不清。近年来的研究发现,腺苷系统是脑内重要的抗癫痫和脑保护系统。腺苷系统通过腺苷与G蛋白偶联腺苷受体的相互作用在脑内发挥重要的神经抑制作用,急性癫痫发作后腺苷水平急剧增高,终止发作,因此腺苷系统被称为“内源性抗癫痫系统”,成为癫痫研究新的热点。腺苷酸如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、(?)磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)及其衍生物腺苷(adenosine, ADO)在一些生理和病理过程中都是重要的信号分子。研究证明,腺苷是一个有效的抗惊厥剂,并具有神经保护特性。研究证实,给予致惊厥药物后,在癫痫发作间期和发作期间大鼠海马内腺苷释放明显增加。腺苷和腺苷A1受体激动剂能明显地保护急性给予戊四氮的大鼠,避免痫性发作。这些都提示内源性腺苷具有神经保护和抗惊厥的作用。而且实验性癫痫发作使脑内腺苷水平升高,在许多病理情况下,与人类循环血浆腺苷浓度迅速升高有关。腺苷主要由腺苷酸酶水解腺苷酸而产生。腺苷酸酶能锚定在细胞膜上,在体液中是可溶性的。这些酶包括：(1)三磷酸腺苷二磷酸水解酶家族；(2)腺苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族；(3)5’-末端核苷酸酶。人类血清水解腺苷酸的能力依赖于循环中可溶性核苷酸酶的存在。ATP通过可溶性磷酸二酯酶作用首先地转换成AMP和无机焦磷酸。相反ADP通过三磷酸腺苷二磷酸水解酶优先地转换成AMP和无机磷酸。最后AMP通过可溶性5’-核苷酸酶水解成腺苷。腺苷主要通过激活高亲和力抑制性腺苷A1受体和兴奋性腺苷A2受体来发挥作用。腺苷酸酶控制腺苷酸和腺苷酸受体配体的有效性。在戊四氮诱导的大鼠癫痫发作产生了腺苷酸水解的变化。Bonan等研究证实,在匹鲁卡品和红藻氨酸点燃的癫痫大鼠模型的海马和脑皮质的突触小体内,ATP二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性升高。在注射戊四氮诱导单次惊厥的大鼠和进行戊四氮点燃诱导癫痫发作的大鼠血清ATP、ADP和AMP水解率显著增加,证明三磷酸腺苷二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性的显著升高,提示血清核苷酸酶途径的刺激可能在减弱癫痫发作事件中起一定作用。目前有关癫痫患者发作后腺苷酸酶活性的动态变化的研究甚少。目前,磷酸-硝基酚-5’-一磷酸胸苷(p-nitrophenil-5’-thymidine monophosphate, p-Nph-5’-TPM)已经被用为磷酸二酯酶的人工底物,产生磷酸-硝基酚。现通过测定癫痫患者血清ATP、ADP、AMP水解率和可溶性磷酸二酯酶活性的动态变化,进一步探讨腺苷酸酶在癫痫发作过程中的调节机制。本研究分两部分目的研究癫痫患者发作后各时间点ATP、ADP和AMP水解率的动态变化及其临床意义,探讨ATP、ADP和AMP水解对癫痫发作过程的调节机制。研究对象与方法1.研究对象(1)癫痫组：系我院神经内科2008年06月至2009年10月住院的癫痫患者30例,其中男17例,女13例；年龄12～63岁,平均(30.6±11.2)岁；病程2～31年,平均病程(9±3.8)年。所有患者均行24h视频脑电图检查,监测痫性发作的临床电生理特点,并行颅脑磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)检查。所有患者依据国际抗癫痫联盟癫痫发作分类标准(International League Against Epilepsy, ILAE,1981)进行分类,12例患者为全面性强直阵挛性发作,18例患者为复杂部分性发作。排除神经系统进行性加重疾病、代谢性疾病、心血管疾病。11例患者在抗癫痫药物单药治疗,19例患者在联合治疗中(平均应用药物数目2种)。(2)正常对照组：20人,均来源于我院门诊健康查体者,无癫痫、神经系统疾病及心血管疾病。其中男11人,女9人,年龄20～50岁,平均(28.3±7.86)岁。两组在性别、年龄方面无统计学意义。2.标本采集两组于早晨抽取空腹肘静脉血,均于抽血前1h内安静卧床休息。癫痫患者于肘静脉处置静脉留置针。癫痫组患者抽血样前12h内无痫性发作,于痫性发作后5 min,10 min,20 min,30 min,60 min和10h再抽取血样。所有血样室温静置30～60 min,4℃下离心3000r/min 15 min,取上层血清置于Eppendorf管,-70℃冰箱保存待测。3.ATP、ADP、AMP水解率的测定按Bruno等报道进行ATP、ADP、AMP水解率的测定。含有5 mmol/L CaCl2和44 mmol/L Tris-HCl溶液共175 ul,pH值调节为8.0(测定AMP水解时pH 7.2)。加入5 ul血清,在37℃下预孵育10min。加入10ul ATP或ADP或AMP,最终达到1.0 mmol/L的反应浓度,37℃下孵育10 min。加入200 ul10%三氯醋酸终止反应。630 nm处测定吸光度。所有血样均测定三次。酶活性用每分钟每毫升血清释放的无机磷酸盐量(nmol)表示。结果1.所有患者中24例24小时视频脑电图检查检测到尖波或棘波或尖慢综合波或棘慢综合波或多棘慢综合波或多棘波,6例未检测到癫痫样放电波。头颅MRI检查有13例检出异常,包括颅内占位、颅内软化灶、脑萎缩、海马硬化等。30例病人中,3例有颅内感染史,2例有脑血管病史,2例有颅脑外伤史,1例有脑萎缩史,1例有颅脑手术史。2.与正常对照组相比,癫痫组发作间期ATP、ADP和AMP的水解率差异无统计学意义,癫痫发作后ATP、ADP和AMP的水解率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.与正常对照组相比,癫痫组发作后5 min, ATP水解率显著升高,20 min达高峰,60 min时仍保持高水平,10h后恢复至基线水平。4.与正常对照组相比,癫痫组癫痫发作后5 min, ADP和AMP的水解率显著升高达高峰,一直增高至30 min,60 min时ADP的水解率恢复至基线水平,而AMP水解率较正常对照组明显下降,10 h恢复至基线水平。ADP大部分与AMP水解变化相一致。结论1.癫痫发作间期,ATP、ADP和AMP的水解率未见明显升高。2.癫痫患者发作后,ATP、ADP和AMP的水解率明显升高。3.ADP与AMP水解变化大部分相一致。4.癫痫发作后可能存在腺苷酸酶活性升高,腺苷酸酶活性增高可能参与了癫痫发作终止的调节机制。目的研究癫痫患者发作后各时间点可溶性磷酸二酯酶活性的动态变化及其临床意义,探讨腺苷酸酶对癫痫发作过程的调节机制。研究对象与方法1.选择癫痫患者30例和正常对照者20人,12例患者为全面性强直阵挛性发作,18例患者为复杂部分性发作。2.两组于早晨抽取空腹肘静脉血,癫痫组于癫痫发作后5 min、10min、20 min、30min、60 min和10h抽取肘静脉血,取血清,-70℃冰箱保存待测。3.磷酸二酯酶活性测定按Bruno等报道进行磷酸二酯酶活性测定。含有0.5 mmol/L p-Nph-5’-TPM和40 mmol/L Tris-HCL溶液共230 ul,调节pH值至8.9。37℃预孵育10 min。加入20 ul血清开始反应,37℃孵育10 min。加入750ul 0.2mol/L NaOH终止反应。在400 nm吸光度处测定磷酸-硝基酚的量。酶活性用每分钟每毫升血清释放的磷酸-硝基酚量(nmol)表示。4.应用OLYMPUS AU600全自动生化分析仪检测癫痫组和正常对照组血清样本中LDH活性。结果1.与正常对照组相比,癫痫组发作间期血清可溶性磷酸二酯酶活性差异无统计学意义,癫痫发作后较对照组诸项明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.与正常对照组相比,癫痫组发作后5 min,血清可溶性磷酸二酯酶活性显著升高,20 min达高峰,60 min时仍保持高水平,10h后恢复至基线水平；癫痫发作后磷酸二酯酶活性的变化过程几乎与ATP水解率的变化过程相一致。3.癫痫组发作后血清LDH活性与正常对照组相比无统计学意义。结论1.癫痫组发作间期血清可溶性磷酸二酯酶活性未见明显升高。2.癫痫患者发作后,血清可溶性磷酸二酯酶活性明显升高。癫痫发作后磷酸二酯酶活性的变化过程几乎与ATP水解率的变化过程相一致。3.癫痫患者发作后,血清LDH活性无明显升高。4.腺苷酸酶活性增高可能参与了癫痫发作终止的调节机制。