嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌,可引起动物的败血症和人类腹泻,同时也是水产养殖中常见的条件致病菌,每年由该菌导致的鱼类爆发性流行病给水产养殖业造成严重的经济损失,引起研究人员的高度重视。目前水产养殖中常常使用抗生素预防与治疗鱼类疾病,导致嗜水气单胞菌等病原菌产生耐药性。此外,嗜水气单胞菌在自然环境中易形成生物被膜,一种与浮游态相对应的生活方式,在细菌耐药与致病过程中发挥重要作用。因此研究浮游态和生物被膜状态下嗜水气单胞菌抗生素耐药相关蛋白及其功能,对治疗与预防该菌具有重要的意义。本试验首先采用TMT标记结合LC-MS/MS质谱分析的定量蛋白质组学技术,以生物被膜状态下的嗜水气单胞菌为研究对象,对金霉素(Chlortetracycline, CTC)应激与遗传获得性耐药两种条件下,细菌表达差异蛋白进行了较系统的比较分析。结果发现,应激处理下(即Ah-CTC-O+CTC比Ah-CTC-O)共有66个蛋白发生变化,其中24个蛋白下调表达,42个蛋白上调表达,而获得性耐药性下(即Ah-CTC-R比Ah-CTC-O)有66个蛋白下调表达,75个蛋白上调表达,共141个蛋白发生变化。细菌在应对抗生素胁迫的应激性耐药,以及获得性耐药性之间,具有中度的相关性,提示两者具有密切的进化联系。生物信息学分析发现,翻译相关蛋白在两者之间都显著性上调表达,脂肪酸生物合成相关蛋白在应激性下上调表达,其他一些代谢途径包括丙酸代谢、不同环境中的微生物代谢和次生代谢产物的生物合成相关蛋白在获得性耐药中表达下降。然后利用q-PCR技术比较脂肪酸生物合成和丙酸代谢相关基因mRNA的转录表达,发现脂肪酸生物合成途径的转录水平与蛋白质表达水平基本一致,而丙酸代谢途径的转录水平表现为较大的波动,约50-60%的相关基因转录水平与蛋白水平一致。最后,通过测定CTC与脂肪酸生物合成抑制剂三氯生(Triclosan, TCS)协同作用下细菌的存活率,发现当抑制脂肪酸合成途径后,细菌对抗生素显著敏感。进一步通过Western blotting技术验证脂肪酸生物合成途径中的FabD蛋白在敏感菌和耐药菌中CTC和TCS作用下的蛋白表达变化。试验结果提示FabD等脂肪酸生物合成相关蛋白在生物被膜下的细菌耐药过程中起着重要作用,同时提出脂肪酸生物合成抑制剂与四环素类型抗生素联用,可以有效抑制细菌的新策略。其次,采用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术,分析浮游态嗜水气单胞菌在CTC应激和获得性耐药性下的差异蛋白。结果发现,应激处理下有116个蛋白上调表达,194个蛋白下调表达,共有310个蛋白发生变化；而获得性耐药性中共有252个蛋白发生变化,93个蛋白上调表达,159个蛋白下调表达。同时发现应激性和获得性耐药性之间共有92个重叠蛋白,表明应激性和获得性耐药性之间有相同的耐药机制应对抗生素胁迫。进而对差异蛋白进行生物信息学分析,发现核糖体亚基蛋白在二者之间都显著性上调表达,与生物被膜结果一致。而细菌趋化性相关蛋白在获得性耐药性中主要是下调表达。然后利用q-PCR技术验证翻译途径和细菌趋化性相关基因mRNA的转录表达,结果发现翻译相关蛋白的转录水平与蛋白质水平一致。进一步利用Western blotting技术验证RplI和GlmS两个翻译相关的蛋白,结果证实应激和获得性耐药性中RplI和GlmS均表达上调,提示RplI和GlmS蛋白可能在游离态细菌耐药中起重要作用。以上试验结果,为研究嗜水气单胞菌耐药机制提供了理论依据,并为新型疫苗的筛选提供了候选的靶点。