【背景】类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）以关节软骨和骨破坏为特征，是一种常见的慢性、系统性炎性机能紊乱的自身免疫性疾病，其病因复杂，发病机制尚不明确。Thl7细胞作为介导炎症反应的辅助性T细胞（Th），在RA发病中过度表达IL-17并通过上调多种促炎因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等以及基质金属蛋白酶（MMPs），于RA病程的各个阶段都发挥着重要的作用。因此，Th17细胞的分化及调控机制成为人们研究热点。现今有关Th17细胞分化的研究主要集中于多种细胞因子作用下的体外培养，而体内是一个相互交错的免疫网络，多种细胞因子及免疫细胞均参与Th17细胞的分化与调控。RA滑膜中浸润着大量的来自骨髓的单核细胞，这些细胞迁移至关节后活化分化为滑膜巨噬细胞。在迁移至关节滑膜的过程中，单核细胞吞噬外源性抗原。在关节中，单核细胞转化的巨噬细胞可以将吞噬消化的抗原递呈给记忆性T细胞，并引发T细胞的活化与分化。近期PNAS有文献报道RA患者体内活化的单核细胞特异性诱导Th17细胞应答，且不依赖TNF-及IL-1等细胞因子作用，而是以细胞接触的方式促进Th17细胞反应。CD147作为一种跨膜分子，可能参与T细胞免疫突触形成与T细胞活化：CD147在TCR/CD3活化的T细胞表达上调，且共定位于TCR/CD3介导的帽形结构或免疫突触中；采用CD147单克隆抗体5A12可下调IL-2及其受体CD25的表达。CD147分子有诸多配体，其中包括CyPA： X线衍射及核磁共振显示CD147与CyPA相互结合位点与肽脯氨酸异构酶（Peptidelprolyl cistransisomersae，PPIase）活性活性位点相重叠。CyPA又为免疫抑制剂CsA作用蛋白受体，有文献报道CsA有抑制免疫突触形成的作用。同时，CD147是一个潜在的粘附分子，可与整合素家族3β1、6β1、4β1等形成复合物，参与细胞粘附等多种生物学作用。CD147与RA关系密切：RA患者滑膜中CD147分子和mRNA表达均显著增高，活动期RA患者的关节组织中CD147的染色范围更为广泛，并且同浸润的巨噬细胞相关。为研究在RA发病机制中，Th17细胞和CD147分子可能参与的重要作用，本实验拟建立体外CD14~+和CD4~+T细胞共培养体系，从而诱导Th17细胞；并在RA和健康人对照中，针对可能与免疫突触相关的CD147分子和其配体（整合素与CyPA），通过阻断实验验证CD147分子和整合素是否参与单核细胞诱导Th17细胞分化的过程。实验内容：【目的】1.摸索活化的CD14~+细胞诱导CD4~+T细胞向Th17细胞分化的最佳条件，建立稳定的诱导Th17细胞的共培养体系。2.验证活化的单核细胞同CD4~+T细胞直接接触作用对Th17细胞分化的促进作用。3.观察比较RA患者与健康人的外周血CD4~+T细胞和CD14~+单核细胞共培养体系中Th17细胞比例，分泌的IL-17含量及其相关细胞因子的表达。4.探讨CD147抗体、 CsA和整合素拮抗剂cRGD对RA患者CD4~+T细胞和CD14~+单核细胞共培养体系中Th17细胞生成、表面分子表达及分化相关细胞因子IL-1β和IL-6分泌的影响。【方法】1.采用免疫磁珠法分离纯化健康人外周血CD4~+T细胞与CD14~+单核细胞，分别在单加CD3mAb、LPS、CD3mAb联合LPS，或CD3mAb联合不同浓度LPS刺激的不同条件下进行共培养（设不加刺激空白对照组）。以流式细胞术检测细胞膜表面分子CD4和胞内细胞因子IL-17及IFN-γ，确定各种刺激条件下，诱导生成的Th17细胞和Th1细胞等亚群占CD4~+T细胞的百分比。2.将分离纯化的健康人外周血CD4~+T细胞与CD14~+单核细胞，分别进行CD4~+T单独培养，CD4~+T细胞与CD14~+单核细胞直接接触或非直接接触共培养，采用方法1确定的最佳条件刺激分化，流式细胞术测定Th17细胞生成比例。3.收集确诊RA的活动期患者及健康人外周血，分别采用免疫磁珠法分离纯化CD4~+T细胞与CD14~+单核细胞，以1：1比例共培养，采用方法1确定的最佳条件刺激分化，流式细胞术测定Th17细胞。为探索CD147和整合素在促进Th17细胞分化中的作用，在上述刺激和共培养条件下设立4种拮抗剂——5A12、HAb18、CsA、cRGD的阻断实验。流式细胞术检测Th17细胞比例及其表面标志CCR4、CCR6和IL-23R表达，ELISA测定上清中IL-1β、IL-6和IL-17含量。【结果】1.单独采用LPS或CD3mAb刺激，分别仅能诱导(1.30±0.19)%、(1.10±0.21)%CD4~+T细胞表达IL-17， LPS联合CD3mAb刺激显著增加Th17细胞比例达（2.01±0.46）%（P﹤0.05）。在抗CD3mAb刺激条件下，设LPS浓度0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，随LPS浓度增加，Th17细胞比例显著减少（P﹤0.05）。LPS体外刺激3天可诱导Th17细胞生成的比例至（2.13±0.32）%，随时间推移，Th17细胞减少（P﹤0.05），而Th1细胞在6天达最高比例（17.45±3.04）%。提示低剂量LPS联合抗CD3mAb活化的单核细胞可在短时间内诱导CD4~+T细胞向Th17细胞分化。2.在实验1确定的适宜刺激条件下，CD4~+T细胞单独培养及非直接接触共培养分别可见Th17细胞比例为(0.61±0.08)%和(1.04±0.36)%，较空白对照，差异无统学意义（P=0.24）。直接接触共培养，刺激后Th17细胞比例显著增高可达(2.39±0.13)%（P <0.01）。提示共培养体系中CD4~+T细胞向Th17细胞方向分化依赖与活化的单核细胞直接接触。3. RA患者外周血的CD4~+T细胞与CD14~+单核细胞共培养体系中较健康人Th17细胞比例，培养上清IL-17水平，表达表面分子IL-23R、CCR4、CCR6的CD4~+T细胞的比例，及Th17细胞分化相关炎性因子IL-1β、IL-6含量，均显著升高； CD147抗体、CsA阻断实验减少Th17细胞、IL-17、IL-1β、IL-6生成，下调表达IL-23R的CD4~+T细胞的比例，cRGD阻断实验减少IL-17分泌，下调表达IL-23R的CD4~+T细胞的比例，提示CD147和整合素可能参与CD4~+T与CD14~+单核细胞相互作用诱导Th17细胞分化的机制。【结论】1.建立了体外诱导Th17细胞的单核细胞与T细胞共培养体系。2.证实了以小室隔离CD4~+T细胞与CD14~+单核细胞直接接触降低Th17细胞分化比例，提示与活化的单核细胞间的直接接触作用对诱导Th17细胞分化具有重要意义。3.证实了活动期RA患者外周血的CD4~+T与CD14~+单核细胞共培养体系中Th17细胞及IL-17水平均显著高于健康对照，提示RA可能与Th17细胞升高相关。4.发现了免疫抑制剂CsA对Th17细胞的诱导分化过程具有显著抑制作用，可能为CsA临床治疗机制提供理论基础与支持。5.发现了阻断CD147与整合素的作用可显著抑制Th17细胞诱导分化过程，从而提示CD147与整合素的作用对参与RA发病机制中的Th17细胞可能具有重要意义。