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肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病,肿瘤的治疗一直是困扰人类的难题。在恶性肿瘤的三大疗法中,化学药物治疗占有重要的地位,但是化疗药物存在价格昂贵、靶点单一、毒副作用大等缺点。中药防治肿瘤具有多部位、多环节和多靶点的特性,且可提高药物抗肿瘤疗效,减轻药物的不良反应,并减少多药耐药问题的出现。因此,如何从中草药中发掘有效的抗肿瘤活性成分,并阐明其作用机理,已成为中医药研究的重要内容。常用于治疗肿瘤的中药有补益类药、活血化瘀药、清热解毒药、利水渗湿药等,其中以药性寒凉的清热解毒药所占的比例最大。藤梨根(猕猴桃根)是常用清热解毒药,民间一直有将其用于治疗“无名肿毒”(肿瘤)的用药习惯。本项目前期对藤梨根化学成分进行了系统的研究,得到了一些乌苏烷三萜类化合物,同时采用MTT法对4个含量相对较高(mg级)单体化合物A、B、C、D进行了体外抗肿瘤活性初筛。结果表明化合物D,即2b,3β,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(2b,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid,TUA)对NCI-H460和HeLa细胞抗肿瘤活性相对较高(IC50值分别为12.15±1.15μg·mL-1,18.46±2.09μg·mL-1)。但有关该化合物抗肿瘤活性方面的研究目前未见有报道。[目的]在前期研究基础上,本项目主要研究TUA对肺癌细胞株NCI-H460及人宫颈癌细胞株HeLa增殖抑制的作用效果,进一步从分子水平探讨其抗肿瘤作用机制,以期阐明藤梨根抗肿瘤作用的药效物质基础,为中草药藤梨根的深入研发提供理论依据。[方法](一)TUA对肺癌细胞株NCI-H460及NF-κB信号通路的影响研究1.TUA体外抗NCI-H460细胞增殖作用研究用RPMI1640体外培养NCI-H460细胞株。不同浓度TUA处理NCI-H460后,采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒Cytotoxicity Detection KitPLUS测定LDH释放率来判定细胞活性;采用免疫比色法测定在DNA合成过程中掺入的BrdU检测细胞增殖情况;采用细胞计数试剂盒CCK-8检测细胞活力;使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率;采用流式细胞术(FCM)分析不同浓度的TUA处理后对NCI-H460细胞周期分布的影响;实时定量PCR(RT-PCR)检测细胞凋亡相关基因bax,bcl-2,caspase-3,p65,survivin等mRNA表达;Western Blot分析p65,IkBa,p-IkBa,bax,bcl-2,caspase-3,survivin等NF-κB信号通路相关蛋白的表达;应用EMSA法研究NF-kB与DNA结合活性;免疫细胞化学染色(ICC)观察NCI-H460细胞内抗原NF-kB、IkBa表达。2.TUA体内抗NCI-H460细胞增殖作用研究采用NCI-H460细胞裸鼠移植成瘤,再把裸鼠传代2代以上的瘤块,使用解剖针接入裸鼠右肢皮下部位,建立人肺癌裸鼠异体移植瘤模型。接瘤后待移植瘤体积约50mm3,将小鼠随机分成6组:(1)模型组;(2)10mg/kg顺铂给药组;(3)10mg/kgpdtc)组;(4)tua高剂量组(30mg/kg);(5)tua中剂量组(12mg/kg);(6)tua低剂量组(6mg/kg),腹腔注射给药,连续14天,观察各组对移植瘤模型动物的体重、瘤体积和瘤重的影响,绘制肿瘤体积生长曲线计算抑瘤率和肿瘤指数;采用he染色观察裸鼠肿瘤组织病理学改变;采用免疫组化和westernblot检测tua对肿瘤组织中nf-κb相关信号通路蛋白表达的影响。(二)tua诱导宫颈癌hela细胞凋亡及其机制初步研究用e-mem体外培养nci-h460细胞株,不同浓度tua处理nci-h460后,采用乳酸脱氢酶(ldh)试剂盒cytotoxicitydetectionkitplus测定ldh释放率来判定细胞活性;采用免疫比色法测定在dna合成过程中掺入的brdu检测细胞增殖情况;采用细胞计数试剂盒cck-8检测细胞活力;dapi荧光染色观察细胞凋亡形态学变化;apo-one?homogeneouscaspase-3/7assaykit试剂盒用于检测分析蛋白酶-3/7活性;应用nf-κb(p65)转录因子分析试剂盒transcriptionfactorassaykit衡量nf-κb的激活水平。[结果](一)tua通过下调nf-κb表达抑制肺癌细胞株nci-h460增殖研究1.tua体外抗nci-h460细胞增殖作用研究与对照组比较,三种不同浓度的tua(10,20,30μg/ml)处理nci-h460细胞后,细胞中ldh释放增加,cck-8检测结果也显示,肿瘤细胞的活性也降低,并且tua对nci-h460细胞的细胞毒性均呈现一定的浓度和时间依赖性;brdu检测结果证实tua分别处理nci-h460细胞后,细胞增殖率不断地降低,tua对nci-h460细胞增殖率的影响呈现一定的浓度和时间依赖性;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期结果表明,浓度为10,20,30μg/ml的tua分别处理nci-h460细胞24h后,细胞凋亡率不断地增加,tua主要将肿瘤细胞阻滞于g0/g1期;经rt-pcr检测分析其凋亡相关基因变化情况,结果表明随着tua剂量的增加,p65,survivin,bcl-2mrna表达下调,而bax,caspase-3mrna表达上调;30μg/mltua作用效果与10μg/ml阳性对照药物pdtc相当;westernblot检测结果显示随着tua剂量的增加,与nf-κb相关的p65,p-ikba蛋白表达水平下降,与此同时ikba蛋白表达水平增加,而与凋亡相关蛋白的survivin,bcl-2蛋白表达受到抑制,bax,caspase-3蛋白表达上调,30μg/mltua作用效果与10μg/ml阳性对照药物pdtc相当;emsa实验结果说明随着tua浓度的增加,细胞中nf-κb蛋白与其特异性结合的dna之间的结合作用逐渐减弱;icc结果也证实不同浓度的tua处理nci-h460细胞后,细胞中p65表达水平下调,而ikba表达上调。2.tua体内抗nci-h460细胞增殖作用研究体内实验结果表明给药后,裸鼠体内瘤组织变小;随着tua剂量的不断增加,瘤组织也越来越小,尤其是在TUA高剂量(30mg/kg)时,其肿瘤组织大小与NF-kB抑制剂PDTC(10mg/kg)相当;HE染色观察结果证实TUA处理过的肿瘤组织肿瘤坏死程度和核分裂象明显降低;免疫组化结果表明TUA处理组与模型组比较,p65在肿瘤组织中表达降低,而IkBa表达增加;Western blot法检测结果也表明,与NF-κB相关的p65蛋白表达水平下降,与此同时IkBa蛋白表达水平增加;与凋亡相关蛋白的Survivin蛋白表达受到抑制,Caspase-3蛋白表达上调。(二)TUA诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其机制初步研究用TUA处理过的HeLa细胞,LDH释放增加,呈剂量和时间依赖性。在CCK-8和BrdU测定过程中,随浓度和作用时间的增加,细胞的活性不断下降,对HeLa增殖的抑制作用明显;DAPI染色观察发现,用TUA处理过的HeLa细胞浓缩明显,细胞核分散,染色质凝聚,出现凋亡小体;TUA以剂量依赖的方式显著增加了Caspase-3/7的活性;TUA对NF-κB的p65亚基的活化就有显著地抑制作用,并且呈一定程度的剂量依赖性。[结论]1.TUA对多种肿瘤细胞有显著的抑制作用,其中对NCI-H460细胞与HeLa细胞较敏感,并且能以时间与剂量依赖地方式抑制两种肿瘤细胞的增殖;2.TUA可引起NCI-H460细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,其机制与调节细胞凋亡相关蛋白的表达有关,并主要是调节NF-kB蛋白及与之相关通路成员;体外、体内实验结果均表明,TUA通过下调肺癌细胞NF-κB表达而起到抗肿瘤作用;3.TUA可明显诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡,并呈浓度依赖性,其作用机制可能与其激活Caspase-3/7、抑制NF-κB活化有关;这也提示TUA诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡与下调NF-κB表达相关,为进一步深入研究其促凋亡作用奠定了坚实的基础;4.TUA有可能作为NF-κB抑制剂,值得更深入的研究。