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有机磷农药毒死蜱是一种具有显著环境毒性的化学物质,目前在农业生产中用量很大。玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)HW-D3菌株可高效降解毒死蜱,是毒死蜱污染生物修复的优良菌株,可用于基因工程菌构建的研究。本实验获得以下主要研究结果。1.采用抗生素梯度平板法,测定了HW-D3菌株对常用抗生素的抗性。Chl、Km、Tc、Str、Ery、Amp和Neo对HW-D3菌株的最低抑制浓度(MIC)分别为:10μg/mL、3μg/mL、3μg/mL、0.5μg/mL、0.5μg/mL、4μg/mL、3μg/mL。HW-D3菌株在含30μg/mL Chl的LB培养基上可以生长但比较缓慢,对Km、Tc、Str、Ery、Amp和Neo六种常用抗生素比较敏感。几种抗生素都可以作为HW-D3菌株遗传转化的筛选压力。2.测定了HW-D3菌株的生长曲线和降解活性,0~12h为HW-D3菌株的延缓期,12~24 h为对数生长期,之后进入稳定期和衰亡期。培养48h时HW-D3菌株对毒死蜱的降解活性达到最高,而在细胞生长旺盛的对数期活性较低。3. HW-D3菌株有一定的自养能力,高浓度的毒死蜱会抑制HW-D3菌株的生长。实验中未发现水解圈等适合作为遗传转化筛选标记的菌落特征。4.采用碱裂解法中量提取HW-D3菌株的质粒DNA。HW-D3菌株细胞中有一个分子量约15kb的质粒,拷贝数较少,不易于分子生物学操作,不适合用于构建遗传转化载体。为降低载体构建难度,减少后续实验工作量,本实验以Toru Matsui等构建的Rhodococcus-E.coli穿梭质粒表达载体pNC9501为材料构建载体,并研究HW-D3菌株的遗传转化方法。5.采用pNC9501质粒成功转化E.coli5α菌株,转化率为1.01×102个转化子/μg质粒DNA。6.采用电转化和原生质体转化两种方法研究HW-D3菌株的遗传转化方法,但均未得到质粒pNC9501的阳性转化子,可能由于HW-D3菌株的限制性内切酶系统活性较高,阻碍了外源DNA的转入。有待进一步研究建立、完善HW-D3菌株的遗传转化方法。7.为研究HW-D3菌株在环境中的检测,本实验以E. coli WA 803菌株为供体菌,以E. coli HB101菌株为辅助菌,采用三亲接合的方法把带有luxAB的pTR102质粒转入受体菌HW-D3菌株中,但未取得成功。8.采用真细菌通用FISH探针EUB338与纯培养的HW-D3菌株进行荧光原位杂交,杂交后的菌体亮度高,外形清晰,杂交率较高,表明HW-D3菌株细胞对该探针有较好的渗透性,探针可以进入细胞与rRNA分子杂交,为后续实验设计特异性探针进行杂交,进而在环境中原位检测HW-D3菌株提供了实验参数和技术基础。