论文部分内容阅读
目的:在外周神经损伤之后,神经轴突再生会受到各种基因的严密调控。c-myc基因作为一种转录因子,调控细胞生长,凋亡等多种生理活动。最近的研究结果表明过量表达转录因子c-myc能够影响受损视神经的轴突再生。本课题拟探讨外周神经损伤之后,转录因子c-myc对其轴突再生的作用。方法:1.利用小鼠坐骨神经切断模型,通过RT-PCR和Western Blot的方法检测小鼠坐骨神经受损之后1、3、7天时背根神经节结(dorsal root ganglion,DRG)中c-myc的mRNA和蛋白表达情况变化。2.提取小鼠DRG神经元,通过药物或特异性siRNA抑制c-myc表达,体外培养3天后通过免疫荧光染色特异性标记神经轴突并测量其长度。另一方面,将坐骨神经损伤的小鼠在培养7天后取其第4和第5腰椎(L4,L5)的DRG神经元体外培养20小时并用抑制剂处理,固定染色后观察轴突的生长情况。3.使用体外培养小鼠DRG神经元,利用c-myc质粒使c-myc过表达后,分别在(1)促进性底物:层黏连蛋白(laminin)(2)抑制性底物:鞘磷脂(myelin)或CSPGs(chondroitin sulfate proteoglycans,硫酸软骨素多糖蛋白)上培养3天,通过免疫荧光染色检测DRG神经元轴突生长情况。4.利用小鼠活体电转的方法,将包含特异性siRNA或c-myc质粒和/或绿色荧光蛋白质粒电转入成年小鼠与坐骨神经相连的第4和第5腰椎(L4,L5)背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)中。2天后夹断坐骨神经中的神经纤维并在损伤部位做好标记,正常饲养3天后将整个坐骨神经取出,在荧光显微镜下确定其轴突再生长度。在做过坐骨神经损伤的成年小鼠上腹腔注射c-myc的抑制剂,持续一周后,取L4,L5的DRG神经元体外培养20小时,免疫染色后观察神经轴突的生长情况。结果:1.背根神经节神经元中c-myc mRNA及蛋白表达显著增加,并呈现先上升后下降的趋势。2.与对照组比较,利用药物或siRNA抑制c-myc基因功能显著地抑制DRG神经元轴突生长。同时,c-myc抑制剂并不影响坐骨神经损伤1周后的L4-L5的DRG神经元轴突再生。3.在促进及抑制性底物上,利用c-myc质粒过量表达c-myc基因会显著增加体外培养的小鼠背根神经节神经元的轴突生长能力,大大促进轴突生长长度。4.体内DRG中过表达c-myc基因能够显著促进受损坐骨神经中神经轴突的再生。在坐骨神经损伤小鼠身上腹腔注射c-myc抑制剂抑制了L4,L5的DRG神经元本该被增强的轴突再生能力。结论:在周围神经损伤后轴突再生过程中c-myc的表达有明显的上升,并且在轴突再生的过程中c-myc起重要的调控作用。提高c-myc基因的表达水平,能有效促进受损的外周神经元的轴突再生。