马铃薯Y病毒属（Potyvirus）作为植物病毒中最大的属，有大约200种确定和可能的种类，能侵染茄科、藜科等多种植物，严重危害植物生长，造成巨大经济损失。马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）和烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV）是马铃薯Y病毒属中两种典型病毒。近年来，人工合成的microRNA（amicroRNA,amiRNA）的应用为植物抗病毒策略提供了新的途径。amiRNA介导的病毒抗性具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等优点。本研究通过比较PVYN株系和TEV-SD1株系的基因组序列，筛选出高序列相似性并符合miRNA特征的9个靶位点序列，通过改造miRNA319a前体，分别构建了植物表达载体，转化烟草。研究发现利用单miRNA可获得多抗病毒转基因植株，但是抗性与相似性并不呈完全正相关，不同位点碱基错配对靶序列降解的影响存在差异性。实验结果为进一步研究amiRNA介导病毒抗性的产生机制，寻找最佳靶序列，及利用该策略培育多抗病毒转基因植物提供依据。主要实验结果如下：（1）通过PVYN与TEV-SD1序列相似性比对，参考amiRNA的筛选准则，选出9个符合特征的靶序列，分别位于CI、NIa-VPg、NIb、CP基因中。以此设计9对引物，对pre-miRNA319a前体进行改造，构建了植物表达载体pR-amiR-1、pR-amiR-2、pR-amiR-3、pR-amiR-4、pR-amiR-5、pR-amiR-6、pR-amiR-7、pR-amiR-8和pR-amiR-9。（2）将构建的植物表达载体利用冻融法导入农杆菌EHA105。瞬时侵染本生烟，3d后进行miRNA的杂交分析，结果表明构建的amiRNA植物表达载体在植物体内能被成功的加工成amiRNA。（3）将构建的植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草NC89。转化植株均生长正常，与非转化植株无明显差异。再生植株经PCR检测，获得转pR-amiR-1的烟草44株，转pR-amiR-2的烟草38株，转pR-amiR-3的烟草36株，转pR-amiR-4的烟草32株，转pR-amiR-5的烟草41株，转pR-amiR-6的烟草32株，转pR-amiR-7的烟草38株，转pR-amiR-8的烟草35株，转pR-amiR-9的烟草32株。（4）T₀代植株自交得到的种子置于含卡那霉素（100mg/L）的筛选培养基上进行筛选，每个株系随机选取若干株于温室移栽，待T₁代转基因烟草长至4⁵叶期时接种PVY^N与TEV-SD1。抗病率统计显示，人工构建的pR-amiRs载体能赋予转基因烟草对PVY^N与TEV-SD1的抗病性，但不同pR-amiRs载体之间抗病性存在差异。（5）转基因植株的Northern blot分析表明，转基因在RNA水平上得到了表达，抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株，抗病植株中有大量amiRNA存在，抗性与amiRNA积累量呈正相关，表明病毒抗性是由amiRNA介导的。5′RLM-RACE验证结果显示，amiRNA能准确的指导mRNA靶序列的剪切。（6）转基因植株的Southern blot结果表明，转基因烟草基因组中至少存在1⁴个拷贝的转基因整合。结合植株抗性分析，发现拷贝数与植株抗病性之间没有必然联系。（7）分析比较影响amiRNA介导抗性产生的因素发现，amiRNA与靶序列存在1⁴个错配仍能介导较高抗性；当错配数低于4个时，抗性水平与错配个数之间无明显规律，单miRNA介导多病毒抗性与靶序列相似性无完全正相关性；3′端碱基的错配仍可获得较高的抗性水平，表明miRNA对于3′端错配存在一定容忍度。（8）对T2代的部分单拷贝转基因植株的抗病性分析结果发现，抗性植株的后代表现较高的抗病率，表明由amiRNA介导的病毒抗性在T2代植株中能够稳定遗传。