研究背景急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一种由严重感染、休克、创伤等心源性以外的因素所导致的以肺泡上皮及毛细血管内皮细胞损伤、炎症因子诱导和中性粒细胞积聚为特征的疾病。尽管ALI的病因病理研究取得了进展,但治疗上除了机械通气策略及生命支持治疗外,可选择方式仍较为局限,其临床病死率可高达50%左右。炎症学说已成为目前主流理论,可以从本质上解释抗凝/纤溶系统不平衡学说、氧化/抗氧化失衡学说及细胞凋亡学说等多层面之间的关系,而持续的、未消退的炎症是各种肺损伤和纤维化的触发因素。因此,如何从炎症反应的强度（大小）及持续的长度（时程）这两个不同的方面对炎症反应进行调控,探索ALI的发病机制及治疗方法,最终让机体回到正常的稳态是临床工作者亟待解决的问题。邓氏清霾汤是国医大师邓铁涛通过对千金苇茎汤加减化裁而来,其具有清热解毒、活血祛瘀功效。课题组前期临床研究中已证实该方可减轻痰热郁肺型急性肺损伤患者的炎症反应,降低Murray肺损伤评分及减少呼吸机使用时间。随后开展了邓氏清霾汤防治PM2.5诱导大鼠肺损伤炎症反应的机制研究实验,发现可改善PM2.5诱导肺损伤大鼠的症状,减轻炎症反应,降低肺组织病理损害程度,并呈现出一定量-效关系,其减轻炎症反应可能是通过调控TLR4/NF-κB信号通路上相关蛋白表达来实现。但是,PM2.5多诱导慢性肺损伤模型,而临床上急性肺损伤亦不在少数,如新型冠状病毒感染的肺炎（corona virus disease 2019,COVID-19）导致的“细胞因子风暴”所造成ALI。为了更加具体量化邓氏清霾汤调控ALI炎症强度及阐明可能作用机制,为中药减轻“细胞因子风暴”提供一种新的治疗手段。本研究在此基础上,拟采用脂多糖（LPS,Lipopolysaccharide）气管内滴注建立ALI炎症消退自限性模型,并通过高通量测序对其可能机制进行探讨。研究目的（1）构建LPS诱导小鼠ALI炎症消退的自限性模型。（2）观察邓氏清霾汤对LPS诱导ALI的生存保护效应。（3）评估邓氏清霾汤促进LPS诱导ALI的炎症消退的作用。（4）探索邓氏清霾汤促进ALI炎症消退可能作用机制及靶点。研究方法选用6-8周龄雄性健康C57BL/6小鼠,通过气管滴注LPS方法构建炎症消退模型,造模后分别在0、1、4、7、10时间点处死小鼠。根据处死时间点分别设置假手术组（SHAM组）、LPS组、邓氏清霾汤组,其中邓氏清霾汤组在LPS处理前2 h予相应剂量的中药灌胃,LPS对照组给予同等体积生理盐水灌胃,连续10 d。首先检测造模后小鼠一般情况,体温体重变化曲线,利用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠外周血和BALF（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平,并运用流式对BALF进行中性粒细胞计数,绘制出消退曲线,计算消退指数（Resolution interval,Ri）及高峰期中性粒细胞数目（Ψmax）,从而建立LPS诱导ALI炎症消退的自限性模型。其次,评估邓氏清霾汤干预后小鼠一般情况,通过生存曲线来观察对小鼠生存率的影响;通过苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin stain,H&E）观察肺组织形态;通过肺干湿重比（wet to dry ratio,W/D）评估肺水肿指标;通过肺组织免疫荧光检测（Immunofluorescence,IF）评估肺组织中性粒细胞浸润情况;通过13因子Bead检测筛选出邓氏清霾汤干预后下调炎症因子;通过蛋白质定量检测（Bicinchoninic acid,BCA）评估BALF中蛋白质含量;并通过流式法比较邓氏清霾汤干预后Ri及Ψmax变化情况。最后,对LPS组及邓氏清霾汤干预组小鼠进行RNA-seq测序,通过PCA（Principal Components Analysis,PCA）比较组内及组间关系;通过热图进行聚类分析;通过DESeq软件筛选差异基因进行GO（Gene Ontology）及KEGG pathway富集分析,找出关键通路;利用STRING网站在线预测各基因间的蛋白互作关系,并借助cytohubba插件找出关键基因;在肺组织中对测序结果进行验证。并应用中药含药血清对LPS刺激RAW264.7进行体外实验验证,通过CCK8法检测邓氏清霾汤含药血清对RAW264.7细胞活性的影响;运用激光共聚焦免疫荧光检测含药血清对LPS刺激RAW264.7细胞NF-κB入核影响,运用Western Blot对NF-κB p65蛋白进行检测;通过ELISA法检测含药血清对LPS刺激RAW264.7细胞上清炎症因子影响。研究结果实验一:（1）小鼠一般情况:实验全过程中假手术组小鼠状态好,未见异常。LPS组多数小鼠于造模后出现精神萎靡,反应迟钝,偶出现气喘症状,甚至出现蜷缩战栗现象。（2）体温体重情况:假手术组实验全程小鼠体温在36.5℃上下波动,LPS造模第1,4,7天与第0天组内比较（P<0.05）。假手术组小鼠体重匀速增长,LPS组第1、4、7、10天组间体重有统计学均（P<0.01）。（3）炎症消退曲线:LPS诱导急性肺损伤的Ri为3.8天,Ψmax为201.5×10~6。（4）炎症因子表达:相对于假手术组,LPS组血清及BALF中TNF-α和IL-6的水平显著升高（P<0.001）。实验二:（1）小鼠一般情况:造模第1到7天,邓氏清霾汤治疗组小鼠精神状态大体好于LPS组,能饮水,行动稍有迟缓,对刺激反应强于LPS组,皮毛无光泽,但较少出现倒毛,出现咳嗽、气促的次数及症状均轻于LPS组。（2）生存曲线:假手术组全程未出现死亡情况,生存率为100%。LPS组的生存率为60%,邓氏清霾汤组生存率为90%,经Log-rank检验,邓氏清霾汤可降低LPS诱导急性肺损伤所致的死亡率（P<0.05）。（3）炎症因子:与LPS组相比,邓氏清霾汤可降低TNF-α（P<0.01）、IL-6（P<0.05）、MCP-1（P<0.05）、IL-1β（P<0.05）的表达;此外,邓氏清霾汤可上调BALF中IL-10表达（P<0.05）。（4）炎症消退:邓氏清霾汤组Ψmax为155.0×10~6细胞,Ri为2.1天;LPS组Ψmax为201.5×10~6,Ri为3.8天,提示邓氏清霾汤干预可减轻LPS诱导急性肺损伤的炎症强度及持续时间,并促进其炎症消退。（5）中性粒细胞的浸润:与LPS组比较,邓氏清霾汤组可减轻中性粒细胞浸润（P<0.05）,该实验结果表明邓氏清霾汤干预可显著减少小鼠肺组织中性粒细胞数。（6）巨噬细胞募集:邓氏清霾汤可升高BALF中巨噬细胞的比例,对巨噬细胞进行计数发现,与LPS组相比,邓氏清霾汤可增加BALF中巨噬细胞总数。（7）BALF蛋白水平:与假手术组相比,LPS组BALF中总蛋白浓度显著升高（P<0.001）,邓氏清霾汤预处理后,BALF中总蛋白浓度有所下降（P<0.05）。（8）肺组织形态及病理学:与LPS对照组比较,在第1、4、7天邓氏清霾汤组肺组织破坏相对较轻。对急性肺损伤小鼠肺组织病理学评分,结果显示,与LPS组比较,在第1、4、7天,与LPS组相比,邓氏清霾汤组可降低肺损伤评分,其差异有统计学意义（P<0.05）。第10天时,邓氏清霾汤评分低于LPS组,但差异无统计学意义（P>0.05）。实验三:（1）PCA及热图聚类分析提示邓氏清霾汤干预后,组内差异小,组间差异大,聚类分析清晰。（2）差异基因GO富集分析:BP（biological processes）富集分析与炎症反应（GO:0006954）、防御反应（GO:0006952）、自然杀伤细胞趋化（GO:0035747）、中性粒细胞趋化（GO:0030593）等方面;MF（molecular functions）富集分析与趋化因子活动（GO:0008009）,细胞因子受体结合（GO:0005126）,CCR趋化因子受体结合（GO:0048020）等方面。（3）KEGG pathway:趋化因子介导的信号通路;炎症反应;细胞因子受体相互作用;TNF信号通路;NF-κB信号通路;TLR相关受体通路。（4）蛋白互作分析提示Tnf、Icam1、Ccl4、Il1rn、Cxcr2、Cxcl2为关键基因,并通过Q-RTPCR验证RNA-seq结果。（5）TLR4/NF-κB信号通路蛋白:邓氏清霾汤可降低NF-κB蛋白表达及防止NF-κB入核,并进行体外含药血清验证。（6）炎症因子表达:邓氏清霾汤含药血清干预后,可降低IL-6、TNF-α表达,并呈现一定量效关系。研究结论（1）用浓度为3.75μg/g/小鼠,体积为30μL的LPS通过气管滴注法可成功诱导小鼠急性肺损伤炎症消退的自限性模型,该模型符合急性肺损伤炎症消退的主要特征。（2）LPS诱导ALI模型可造成小鼠出现肺损伤表现,引发炎症反应,造成肺组织病理损害。邓氏清霾汤对可减轻LPS诱导ALI的症状,减少蛋白渗出及中性粒细胞浸润,从而降低死亡率。（3）邓氏清霾汤可促进LPS诱导ALI的炎症消退,减轻炎症反应的强度及持续时间。（4）邓氏清霾汤促进LPS诱导ALI炎症消退是通过调控TLR4/NF-κB信号通路,防止NF-κB入核而发生炎症级联反应。