目的:肝激酶B1(liverkinase b1,LKB1)近年来越来越受到学者们的关注,不仅因其在体细胞中发挥着强大的抑癌功能,还因其在各类免疫细胞及造血干细胞中发挥着维持细胞稳态的作用。羊膜间充质干细胞(amniotic mesenchymal stem cell,AMSC)拥有多潜能干细胞特性且在体外能抑制T细胞增殖和分化,并成功诱导外周T细胞转变为调节性T细胞(regulatory cells,Treg),发挥免疫负调控作用,从而抑制机体过激的免疫反应。转录因子LKB1在既具有干细胞特性,又拥有免疫调节功能的AMSC细胞中会起着怎样的作用,国内外尚无相关报道。本研究利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术成功在AMSC中特异性敲低LKB1基因表达,进而探讨LKB1在AMSC细胞生物特性及免疫调节功能中所起的作用。方法:采用组织块分离培养的方式,获得来自健康足月剖宫产胎盘羊膜的AMSC,并对其形态、表面标志及体外分化能力进行鉴定,证实其符合国际干细胞研究学会对MSC的界定。通过bioGPS基因信息数据库分析,得知LKB1在MSC相对高表达,随后采用Real-time PCR及Western blot分别在mRNA及蛋白水平检测AMSC中LKB1的表达情况,证实LKB1在AMSC中确实表达。为探讨LKB1在AMSC基本细胞生物学特性及免疫抑制中所起的作用,以引物的形式合成3条shRNA-LKB1的DNA片段,通过退火合成DNA双链并连接在PLK0.1-EGFP的载体上。经测序验证后,筛选成功连接于载体上的shRNA-LKBl菌落,并提取相关质粒。采用四质粒慢病毒包装系统,包装并浓缩慢病毒用于后期AMSC的感染。然后通过流式分选仪分选出转染成功的AMSC,扩增得到特异性敲低LKB1的AMSC。特异性敲低LKB1且增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGPF)阳性的AMSC,后期简称SK;而转染空白对照质粒的AMSC表现仅表现为EGPF阳性,后期简称CON。通过Real-time PCR及Western blot分别在mRNA及蛋白水平检测shRNA的敲降效率。挑取敲降效率最高的shRNA进行后期试验。再次对感染后的AMSC进行鉴定,对AMSC多功能标记基因的mRNA水平进行通过Real-time PCR检测。观察细胞的生长速度,通过集落形成试验、增殖相关基因以及凋亡试剂盒检测,分析SK细胞的增殖能力和凋亡水平。利用细胞示踪紫罗兰细胞增殖试剂盒(celltrace violet cell proliferation kit,Celltrace)对传统 T 细胞(conventional T cells,Tcon)进行标记,通过SK-Tcon共培养后,检测SK对Tcon细胞增殖的抑制能力;采用Real-time PCR检测Th1、Th2的代表基因以及能诱导Treg生成、且由MSC分泌的可溶性细胞因子或膜表面分子,包括干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素10(interleukin-10,IL-10)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、程序性死亡配体-1(programmed death ligands-1,PD-L1)、程序性死亡配体-2(programmed death ligands-2,PD-L2)、吲哚胺2,3-二氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的mRNA水平。并通过流式细胞术检测不同时间点共培养的SK及CON对Treg的诱导比例及Treg细胞中Ki67的表达。结果:通过组织块分离培养的原代AMSC符合国际干细胞研究学会对MSC的界定,利用shRNA特异性敲低LKB1后的SK及CON细胞其基本生物学特性仍符合MSC特征。且三系体外诱导分化及分化相关基因的Real-time PCR分析结果证实,相较于CON,SK向成骨、成软骨方向分化的能力增强,而向成脂方向分化的能力无明显变化。同时特异性敲低LKB1,并不会对AMSC的多潜能标记基因(KIF4、SOX2、REX1、NANOG)产生影响。此外,SK细胞增殖能力显著减弱,凋亡明显增加,导致SK生长速度明显减慢。通过Celltrace试验,发现SK具有抑制Tcon细胞增殖的功能,且此抑制功能相对于对照组显著增强。SK还能显著抑制Th1代表基因表达,增加Th2代表基因的mRNA水平,同时显著提高能诱导Treg生成且由MSC分泌的可溶性细胞因子或膜表面分子的mRNA水平。因此,特异性敲低LKB1可增强AMSC调节T细胞亚群朝着抑炎方向发展,即调整辅助性T细胞(helper T cell,Th)Th1/Th2向Th2分化、诱导Treg生成的能力。在T细胞与SK及CON细胞共培养试验中,我们在蛋白水平再次证实SK在体外具有诱导Treg生成的能力。其中,Treg的诱导比例随共培养时间的延长增加。通过检测诱导性Treg中Ki67的表达,发现SK能显著促进诱导性Treg的增殖。结论:1)在AMSC中特异性敲低LKB1并不影响其基本生物学特性,反而增强其向成骨、成软骨方向分化的能力;2)LKB1在AMSC中通过促进增殖,抑制凋亡而维持细胞的自我更新;3)LKB1在AMSC抑制Tcon细胞的增殖方面起着负向调节作用;4)LKB1在AMSC调节T细胞亚群朝抑炎方向分化方面起着负向调节作用;5)LKB1在一定程度上抑制AMSC对Treg的诱导,且为时间依赖性;6)LKB1在AMSC中负向调节诱导性Treg的增殖。终上所述,LKB1维持着AMSC的自我更新,同时参与AMSC对T细胞的免疫调节而维持机体的免疫平衡。