论文部分内容阅读
2,3-丁二醇(2,3-butanediol,2,3-BD)及其前体乙偶姻(acetoin,AC)都是重要的平台化合物。2,3-丁二醇有两个手性碳原子,表现出三种构型,分别为:(2R,3R)-2,3-BD、(2S,3S)-2,3-BD 和 meso-2,3-BD;乙偶姻有一个手性碳原子,表现出两种构型,分别为:(3R)-AC和(3S)-AC。不同单一构型的2,3-丁二醇和乙偶姻都是重要的潜在药物中间体。实验室前期筛选到一株能以蔗糖和葡萄糖为碳源产2,3-丁二醇的沙雷氏菌,命名为Serratia sp.T241。有趣的是,我们发现Serratia sp.T241在糖发酵过程中可产三种构型的2,3-丁二醇,而天然微生物通常情况下只产(2S,3S)-2,3-BD/meso-2,3-BD或(2R,3R)-2,3-BD/meso-2,3-BD,这暗示Serratia sp.T241在合成2,3-丁二醇异构体过程中存在更为复杂的合成机制。基于此,本论文鉴定了四个同2,3-丁二醇合成相关的候选基因,并通过体外催化实验及体内代谢途径重组装实验揭示了 Serratia sp.T241中2,3-丁二醇立体异构体的形成机制。其次,我们通过基因敲除及酶活分析实验确定了对2,3-丁二醇合成起主导作用的关键酶。最后,我们在本文揭示机制的基础上,探索了全细胞催化meso-2,3-BD合成单一构型(3R)-AC的方法。此外,我们还开发了双细胞偶联催化meso-2,3-BD产(2S,3S)-2,3-BD的新体系,并通过固定化实现了细胞的重复利用。具体工作如下:1.Serratia sp.T241中2,3-丁二醇立体异构体形成机制的推导首先,我们基于已测序的Serratia sp.AS12基因组鉴定了四个同Serratia sp.T241合成乙偶姻与2,3-丁二醇异构体相关的基因,将其命名为bdh1,bdh2,bdh3和gdh。它们编码的氨基酸序列与已报道的粘质沙雷氏菌meso-2,3-BDH、红球菌(2S,3S)-2,3-BDH、多粘芽孢杆菌(2R,3R)-2,3-BDH及粘质沙雷氏菌GDH的同源性高达95%,64%,68%和91%。通过InterPro Scan在线预测,我们发现meso-/SS-BDH和RR-BDH分别隶属于短链脱氢酶超家族和中链脱氢酶超家族,而GDH属于第Ⅲ金属依赖型多元醇脱氢酶超家族。其次,我们将以上四个对应编码BDH1、BDH2、BDH3和GDH的基因进行了克隆、表达,并对获得的蛋白进行纯化和酶学性质分析。结果表明,BDHs/GDH以AC和2,3-BD为底物时均存在酶活,而在以不同构型2,3-BD为底物时表现出了不同的的底物特异性:BDH1与BDH2可以氧化(2S,3S)-2,3-BD 和 meso-2,3-BD,但是不能氧化(2R,3R)-2,3-BD。BDH3与GDH以(2R,3R)-2,3-BD和meso-2,3-BD为底物时存在活性,以(2S,3S)-2,3-BD为底物时则检测不到活性。根据米氏常数Km值和平衡常数Kcat值,BDH1、BDH2、BDH3和GDH依次被认定为meso-2,3-丁二醇脱氢酶、(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶、(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶及甘油脱氢酶。其次,通过酶的体外催化实验及大肠杆菌体内重组装2,3-丁二醇代谢途径实验,我们发现:四种酶均参与了meso-2,3-BD的合成,(3S)-AC在BDH1和BDH2的作用下生成(2S,3S)-2,3-BD,BDH3和GDH则氧化(3R)-AC生成(2R,3R)-2,3-BD。进一步研究酶的体外催化反应的定量结果,我们推导出了 Serratia sp.T241中乙偶姻和2,3-丁二醇立体异构体的形成机制。(3R)-乙偶姻由丙酮酸经α-乙酰乳酸合成酶及α-乙酰乳酸脱羧酶催化生成,部分α-乙酰乳酸在非酶促条件下自然氧化脱羧生成双乙酰,双乙酰在BDH1、BDH2及GDH的作用下生成(3S)-乙偶姻,在BDH3的作用下生成(3R)-乙偶姻。其中,BDH1与BDH2在以混旋型乙偶姻为底物的催化反应中具有显著的S型立体对映选择性,它们催化(3S)-AC和(3R)-AC分别生成(2S,3S)-2,3-BD和meso-2,3-BD;而BDH3和GDH则具有显著的R型立体对映选择性,它们催化(3R)-AC和(3S)-AC分别生成(2R,3R)-2,3-BD和meso-2,3-BD。此外,四种酶均可以催化2,3-BD生成相应构型的AC,说明BDH/GDH作为可逆的酶可执行AC与2,3-BD之间的相互转化。而不论是以2,3-BD为底物还是以AC为底物均无法检测到双乙酰,说明双乙酰与乙偶姻之间的反应是不可逆的。体外催化实验证明了 BDH1、BDH2、BDH3和GDH参与了乙偶姻与2,3-丁二醇之间的相互转化,但在Serratia sp.T241中四个酶实际转录表达水平以及在2,3-丁二醇发酵过程中是否执行了相应的功能并未获得证实。为此,我们构建了四株Serratia sp.T241基因缺失突变株。结果显示,与野生菌相比,Δbdh1发酵产生的meso-2,3-BD和(2S,3S)-2,3-BD分别降低了 97.7%和87.9%。Δbdh3发酵产生的(2R,3R)-2,3-BD降低了 73.3%。酶活测定显示,以混旋型的(3S/3R)-AC为底物,Δbdh1与Δbdh3酶活分别降低了 98.4%和22.4%。综上,BDH1和BDH3在2,3-丁二醇合成中起主导作用,而BDH2和GDH对2,3-丁二醇合成影响较小。2.重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-mbdh-nox-vgb全细胞催化meso-2,3-丁二醇合成(3R)-乙偶姻单一构型乙偶姻可用于合成新型的具有光学活性的α-羟基酮类衍生物及液晶材料等。同时,(3R)-乙偶姻可作为雌性性信息素,用于吸引雄性。然而,自然界中乙偶姻生产菌发酵产物均为外消旋的混合物,限制了乙偶姻的应用。本章我们构建了共表达meso-2,3-丁二醇脱氢酶、NADH氧化酶的重组大肠杆菌,用于全细胞催化meso-2,3-丁二醇合成(3R)-乙偶姻,并于摇瓶中探讨了 pH、温度、菌体湿重、底物浓度、金属离子及反应体积等条件对于催化合成(3R)-AC的影响。在最佳催化条件下,(3R)-乙偶姻产量达82.16 g/L。在优化过程中,我们意外的发现氧气作为辅酶再生的底物严重影响到(3R)-乙偶姻的合成。为此,我们于重组菌中引入了vgb基因编码的透明颤菌血红蛋白VHb,以期提高催化过程中的胞内溶氧量。事实证明,VHb的产生可进一步提高重组菌中(3R)-乙偶姻的产量。最后,我们于5L发酵罐上进行了放大实验。结果表明,以93.73 g/L meso-2,3-丁二醇为底物,(3R)-乙偶姻产量高达86.74 g/L,产率为3.61 g/L/h,手性纯度达97.89%。3.固定化细胞催化meso-2,3-丁二醇产(2S,3S)-2,3-丁二醇单一构型的(2S,3S)-2,3-BD具有重要的应用价值,其前体双乙酰在天然途径中大多由α-乙酰乳酸经非酶促的自然氧化生成,浓度偏低,因此目标产物较难通过糖类物质的直接发酵得到较高浓度的积累。此外,由于双乙酰对细胞和酶有一定的毒性,限制了生物转化的过程。幸运的是,我们前期的研究结果表明,(2R,3R)-2,3-BDH能够以NAD+为辅酶催化meso-2,3-BD生成(3S)-AC,而(3S)-AC同样是合成(2S,3S)-2,3-BD的前体。由于meso-2,3-BD具有无毒及来源广泛的优势,故可成为合成(2S,3S)-2,3-BD的潜在底物。本章开发了双细胞偶联催化meso-2,3-BD产(2S,3S)-2,3-BD的新体系:利用共表达(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶及NADH氧化酶的重组大肠杆菌全细胞催化meso-2,3-BD合成(3S)-AC。以此同时,构建了共表达(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶及甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌,用于进一步将(3S)-AC催化生成(2S,3S)-2,3-BD。首先,我们利用游离细胞在摇瓶中探讨了 pH、温度、菌体湿重、底物浓度及金属离子对于催化合成(2S,3S)-2,3-BD的影响。结果显示,底物浓度低于40g/L时,产物(2S,3S)-2,3-BD转化率达92.5%,手性纯度更是高达96.2%。而当底物浓度大于40 g/L时,(2S,3S)-2,3-BD手性纯度不够理想。为了兼顾产物的浓度及手性纯度,我们以40g/L的meso-2,3-BD为底物,以海藻酸钠为载体,对细胞分别进行了固定化,以期提高全细胞催化系统的可重复利用性,并对海藻酸钠浓度及CaCl2浓度等可能影响凝胶珠渗透性及强度的条件进行了优化。进一步的,我们考察了游离细胞和固定化细胞的使用寿命。结果表明,经过三轮连续的催化,固定化细胞产生的(2S,3S)-2,3-BD为第一轮催化时的81.6%,而游离细胞产量损失了 74.2%,说明固定化细胞具有较好的可重复利用性。