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肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种以腹痛、腹部不适为特征,并伴有大便性状异常和排便习惯改变为特征的一类疾病的症候群。此类病人虽腹部不适,但并未有相应的病理或器质性病变。除腹部症状外,IBS常伴有精神心理异常,特别是反复求医的患者,表现为精神上的苦恼、情感脆弱、睡眠质量差、焦虑、抑郁[1],过于紧张、焦虑或抑郁均是引起胃肠功能异常的主要原因。IBS患者以20～40岁中青年居多,女性患者比例高于男性,全球IBS总患病率在5%～25%之间,其中亚洲国家为5%～10%[2,3]。IBS病程长,症状可反复发作,严重影响患者的生活质量,并占用了大量的医疗资源[4,5]。蜘蛛香是一味云南省多民族共用的草药,是苗药的主流品种之一,在2010版药典(一部)收载[6],具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿和镇静安神的功效。本课题以传统中医药理论、蜘蛛香民间应用及现代药理学为依据进行研究。前期研究表明蜘蛛香生药粉和环烯醚萜部位对慢性应激所致IBS模型大鼠均能改善IBS模型大鼠内脏高敏性、胃肠动力及精神神经系统异常状况[7,8],其对IBS模型大鼠的治疗作用可能与其对从胃肠系统到中枢神经系统5-HT通路的调控作用有关[9,10]。后期研究又从蜘蛛香环烯醚萜部位中分离出的单体成分ZXX、ZXY对多种腹泻小鼠模型均有显著的治疗作用,且二者均可显著抑制5-HT对细胞的收缩作用[11]。为进一步探讨蜘蛛香环烯醚萜类成分ZXX、ZXY对肠易激综合征的治疗作用及其作用机制与中枢5-HT通路的关系。本研究通过观察ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠胃肠运动功能、内脏敏感性、精神神经活动的影响,评价二者对IBS的治疗作用。通过检测中枢色氨酸(Trp)、五羟色胺(5-HT)和五羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量的变化;中枢色氨酸羟化酶(TPH)、单胺氧化酶(MAO-A)的活性及5-HT受体的表达,探讨ZXX、ZXY对中枢5-HT通路的调控作用。1 ZXX、ZXY治疗慢性应激所致IBS模型大鼠的作用研究1.1 IBS模型大鼠的建立方法:140-160g SD雄性大鼠,随机分为:正常对照组,IBS模型组,匹维溴铵组(25mg/kg),氟西汀组(2.5mg/kg),ZXX大、中、小剂量组(1.2mg/kg、0.6 mg/kg、0.3mg/kg),ZXY 大、中、小剂量组(0.6mg/kg、0.3mg/kg、0.15mg/kg)。模型组和给药组的大鼠每笼一只孤养,并加以慢性不可预见性刺激。慢性应激包括:禁水、禁食、昼夜颠倒、冷刺激、热刺激、致痛、致动。7种刺激因子在63天内随机安排,每日一种,每种刺激出现9次,每种刺激不可连续出现,使动物不能预料刺激的发生。ZXX、ZXY各组以及阳性药各组动物造模同时每日灌胃给药。对照组与模型组给予灌胃蒸馏水。以腹部回撤反射评分、排便潜伏期和体重增长率为指标评价动物的内脏敏感性和胃肠功能变化;以糖水偏嗜度为指标评价动物的神经精神活动的变化。具体结果见如下(1.2-1.3)内容。1.2 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠内脏敏感性和胃肠动力的影响140-160g SD雄性大鼠,随机分为:正常对照组、IBS模型组、匹维澳铵组(25mg/kg)、氟西汀组(2.5mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2mg/kg、0.6 mg/kg、0.3mg/kg)、ZXY 大、中、小剂量组(0.6mg/kg、0.3mg/kg、0.15mg/kg)。。在造模前及造模并给药12天、35天和56天时测定各组大鼠的AWR评分;在造模前及造模并给药21天、42天和63天测定各组大鼠的排便潜伏;在造模前及造模并给药10天、15天、30天、37天、49天和57天时测定各组大鼠的体重变化。结果表明:造模前各组大鼠AWR评分、排便潜伏期和体重变化均无明显统计学差异(P>0.05)。造模后,模型组的大鼠AWR评分显著升高(P<0.01),排便潜伏期缩短(p<0.05);体重增长率率开始下降(P<0.05)。ZXX(1.2mg/kg、0.6mg/kg、0.3mg/kg)和 ZXY(0.6mg/kg、0.3mg/kg、0.15mg/kg)均可降低模型大鼠的AWR评分,延长排便潜伏期,但对IBS模型大鼠的体重变化无显著影响。1.3 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠中枢神经系统的影响分组和给药同上(1.2部分)。在造模前及造模并给药20天、42天和63天测定各组大鼠的糖水偏嗜度。用糖水偏嗜度实验体测定动物中枢神经系统的表现。结果显示:在造模前各组大鼠的糖水偏嗜度无明显统计学差异(P>0.05)。造模后,模型组大鼠的糖水偏嗜度降低(P<0.05)。ZXX(1.2mg/kg、0.6mg/kg、0.3mg/kg)和 ZXY(0.6mg/kg、0.3mg/kg、0.15mg/kg)均可改善模型大鼠糖水偏嗜度。2 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠中枢5-HT通路调控作用的研究2.1 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠中枢5-HT通路合成的影响造模方法同上(1.1部分);分组和给药同上(1.2部分)。在造模并给药63天后取材测定。实验结果显示模型组动物皮层中和下丘脑5-HT含量明显降低(P<0.05),海马中 5-HT的表达显著减少(P<0.01)。模型大鼠脑干部位的TPH2mRNA表达有明显上升(P<0.05)。因此推测中枢TPH2mRNA表达的上升是长期慢性应激下中枢5-HT下降后的代偿反应,由此进一步推测,慢性应激所致中枢5-HT水平的下降可能并非由TPH2调控的合成通路所导致的,相反5-HT水平的下降促进了 TPH2mRNA的表达。ZXX(0.6mg/kg)可明显提高皮层中5-HT的含量;ZXX(1.2mg/kg)可明显提高下丘脑中 5-HT 的含量;ZXX(1.2mg/kg、0.6mg/kg)和 ZXY(0.6mg/kg、0.3mg/kg)可明显促进海马齿状回区域5-HT的表达。ZXX和ZXY大剂量均可显著抑制模型大鼠脑干中TPH2mRNA的表(P<0.01),ZXX(1.2mg/kg、0.6mg/kg)和ZXY(0.6mg/kg)可明显抑制模型大鼠脑干中TPH2mRNA的表达(P<0.05)。提示ZXX和ZXY治疗IBS的作用机制可能与促进中枢中5-HT含量有关。2.2 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠中枢5-HT通路代谢的影响造模方法同上(1.1部分);分组和给药同上(1.2部分)。在造模并给药63天后取材测定,实验结果显示:模型组大鼠皮层中 5-HIAA含量明显增加(P<0.05),5-HT转化率(5-HIAA/5-HT)明显提高(P<0.05);下丘脑中各组5-HIAA没有显著统计学差异,但下丘脑中5-HT转化率明显提高(P<0.05)。模型组动物海马中的MAO-A活性显著升高(P<0.01),提示慢性不可预见性应激大鼠脑内5-HT转化率升高;MAO-A的活性增加,提示5-HT转化率增加,可能与MAO-A活性升高有关,其代谢活动加快可能是导致IBS模型大鼠精神症状异常的原因。ZXX可明显抑制皮层和下丘脑中5-HT转化率,ZXY可明显抑制皮层中5-HT转化率;ZXX和ZXY均可明显抑制海马中MAO-A的活性。2.3 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠中枢5-HT3AR mRNA表达的影响5-HT3受体可通过肠神经将应激信号传递至脑,启动脑-肠互动[22]。5-HT3受体主要通过与5-HT结合导致IBS患者腹部不适和内脏高敏性等胃肠道异常[23],并通过对神经递质释放的调节,影响抑郁、焦虑等精神情绪的变化。造模方法同上(1.1部分);分组和给药同上(1.2部分)。在造模并给药63天后取材测定,实验结果显示:实验表明,IBS模型组大鼠海马中 5-HT3AR mRNA 表达显著增加(P<0.01)。ZXX(0.6mg/kg)和 ZXY(0.3mg/kg)可明显降低模型大鼠海马中5-HT3AR mRNA表达(P<0.05)。提示 ZXX和ZXY改善慢性应激所致IBS模型大鼠内脏高敏和精神症状的作用可能与中枢 5-HT3AR mRNA表达增加有关。结论实验采用腹部压力阈值和腹部回撤反射AWR评分指标来评价慢性应激所致IBS模型大鼠的内脏敏感性;用排便潜伏期和体重变化来评价大鼠的胃肠功能状况;用糖水偏嗜度和敞箱实验来评价大鼠的精神状态,增加了药效学评价的可信度。研究结果表明:用禁水、禁食、昼夜颠倒、冷刺激、热刺激、致痛、致动可成功建立IBS大鼠模型。蜘蛛香环烯醚萜类成分ZXX、ZXY均具有改善慢性应激所致IBS模型大鼠内脏高敏性、胃肠功能亢进和中枢神经系统异常的作用。作用机制是通过促进中枢5-HT含量合成,抑制中枢5-HT的分解来实现的。通过本课题的研究为发掘具有我国民族特色的药用资源,深入探讨其物质基础和作用机理提供了实验依据。