解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白鉴定及抑菌机理研究

来源 :山西农业大学 | 被引量 : 12次 | 上传用户:jfwhxl
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真菌病害是引起作物减产与品质降低的主要因素。目前生物防治逐步替代化学农药是一种趋势,然而在生防菌中芽孢杆菌的抑菌作用尤为突出。本文以具有自主知识产权的解淀粉芽孢杆菌菌株HRH317为主要研究对象,对其代谢产生的抑制小麦赤霉病禾谷镰孢菌的抗菌蛋白进行了研究,为其在生物防治应用领域提供理论依据。具体研究内容包括:优化了抗菌蛋白的发酵条件;分离纯化与鉴定了抗菌蛋白;研究了抗菌蛋白的稳定性;阐明了抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌的作用机理;验证了抗菌蛋白的防效、土壤中定殖力及生物安全性评价,结果如下。利用统计学方法优化了菌株HRH317抗菌蛋白的发酵条件。结果表明,抗菌蛋白的发酵最佳条件:在装有30mL pH值为7.0的NB培养液中,接种量4%,37℃下振荡培养24h,转速200r/min,菌株产抗菌蛋白的抑菌效果达到最佳。菌株HRH317发酵液经饱和硫酸铵沉淀得到蛋白粗提物,经DEAE Sepharose Fast Flow与Sephadex G-200柱层析分离纯化得到强烈抑制禾谷镰孢菌的抗菌蛋白。通过SDS-PAGE电泳检测,结果发现:呈现出一条单独条带,其表观分子质量约为36.0kD,测得抗菌蛋白含量为5.81±0.04mg/mL。采用HPLC法检测出抗菌蛋白氨基酸组成成分。抗菌蛋白经过SDS-PAGE电泳之后,将条带切下进行胶内胰蛋白酶酶切,采用纳升液相电喷雾串联质谱(NanoLC-ESI/MS/MS)分析鉴定。经电喷雾串联质谱共获得3个具有代表性的肽序列,分别为ELISNASDALDK、DIQMTQSPSSLSASVGDR. DSTYSLSSTLTLSKo在Matrix Science NCBI数据库中鉴定,尚无发现完全和这些肽段的氨基酸相同的序列。其中发现1个具有相关性的蛋白质,与芽孢杆菌分泌的草酸脱羧酶部分同源,表明菌株HRH317所产抗菌蛋白是一种新的蛋白质。抗菌蛋白稳定性研究结果显示,对热、酸碱有良好的稳定性,对蛋白酶K不敏感、而对胰蛋白酶、胃蛋白酶较敏感;经紫外线照射与反复冻融以后仍然具有良好的抑菌活性。抗菌蛋白抑菌谱非常广,对常见的12种病原菌都有明显抑菌作用,表明了该抗菌蛋白在植物真菌病害防治和食品防腐方面具有广阔的开发与应用前景。采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、细胞膜通透性测定等方法,初步明确了抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌的作用机理。揭示了抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌菌丝生长,抑制孢子萌发,同时造成病原菌细胞器紊乱,细胞质降解,膜通透性增大。同时,该抗菌蛋白对细胞壁的破坏也是重要机理之一,但对禾谷镰孢菌菌丝中蛋白质的合成无显著影响,禾谷镰孢菌蛋白质SDS-PAGE电泳图谱检测结果与之吻合。本文通过光照培养箱及盆栽试验发现,解淀粉芽孢杆菌HRH317对由禾谷镰孢菌引起的小麦赤霉病的防治效果明显,经处理的小麦根部病情指数较对照降低了62.5%,并且有很好的促生作用。经浸种和灌根处理后,该菌株能够很好的在土壤中定殖。经过对回收的土壤中拮抗菌HRH317进行抑菌试验研究表明仍具有抑菌活性,抑菌圈直径达到19.6cm。菌株HRH317通过急毒性试验,结果显示对小白鼠没有致病性,证明了该菌株良好的生物安全性。
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