论文部分内容阅读
目的益气除痰方已经过长期临床实践证明疗效确切,中医药治疗肿瘤作用不可或缺,它是通过延长生存时间,提高生存质量达到“带瘤生存”的目的,本实验旨在进一步探究其抗肿瘤作用机制,从益气除痰方对患者机体免疫功能的影响及益气除痰方含药血清体外对肺癌细胞的增殖及失巢凋亡的影响两个方面进行论证,并探究益气除痰方对PI-3K／akt和MAPK信号传导通路相关蛋白的影响,为建立中药在肿瘤治疗中的地位提供依据。方法1益气除痰方对机体免疫功能的影响采用前瞻性自身前后对照的研究方法,收集合格病例38例,并根据中医辨证论治分为四组：肺郁痰瘀、脾虚痰湿、阴虚痰热、气阴两虚四型,予肺癌标准一线化疗方案及益气除痰方加减治疗,分别在治疗前及化疗第21-28天(下一程治疗前)采集外周血流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群及NK细胞活性。比较治疗前后T淋巴细胞亚群各组比例变化及NK细胞活性变化。2益气除痰方含药血清对肺腺癌A549细胞的增殖及失巢凋亡的影响及作用机制的探究(1)益气除痰方含药血清及对照血清的制备：SD大鼠(150-180g),分为对照组和益气除痰方给药组(药物剂量为等效剂量的10倍)。灌胃5天。末次给药后1小时腹主动脉取血,灭活除菌后-20℃冰箱保存备用。(2)益气除痰方含药血清添加量的确定：MTT法检测检测A549细胞对益气除痰方含药血清及对照血清的敏感程度,确定用药浓度。(3)益气除痰方含药血清对A549细胞增殖的影响：软琼脂集落形成实验观察益气除痰方含药血清对失巢条件下的A549细胞的增殖影响。(4)益气除痰方含药血清对A549细胞失巢凋亡的影响：以Poly-HEMA包被的培养皿下培养经过不同处理的细胞,收集细胞,用于琼脂糖凝胶电泳以从细胞凋亡生化特征方面观察益气除痰方含药血清对A549细胞诱导凋亡的作用；以流式细胞仪PI单染及AV-PI双染定量检测各组细胞的凋亡率。(5)益气除痰方诱导失巢凋亡中对PI-3K和MAPK信号传导通路相关蛋白P-akt、P-p38的影响(Western blot杂交法)。结果1益气除痰方对机体免疫功能的影响：测定机体外周血T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+、及NK百分比用药后较用药前均有显著升高,差值有显著统计学意义(P<0.05),CD4/CD8比值用药后较用药前升高,差异有统计学意义(P＜0.05),CD8+用药后较用药前降低,但差值无统计学意义(P>0.05)。2益气除痰方含药血清对肺腺癌A549细胞的增殖及失巢凋亡的影响及作用机制的研究：(1)益气除痰方含药血清的制备及添加量的确定：本实验给药方案采用每天灌胃2次,间隔8小时,灌胃后1h取血,制备血清后-20℃冰箱保存备用。MTT比色试验中,A549细胞活性在空白组与阴性组无明显差异(P<0.05),可排除大鼠血清本身因素对A549细胞生长的干扰；A549细胞活性随着含药血清浓度的变化而变化,含药血清可抑制A549细胞的增殖,且具有浓度依赖性；但是血清浓度>25%时,细胞生长状态较差,呈空泡状改变,结合含药血清对细胞活性的影响,最终确定10%(低剂量)、20%(中剂量)、30%(高剂量)三个浓度的含药血清为实验剂量。(2)益气除痰方含药血清对A549细胞增殖的影响：软琼脂集落形成实验中,A549细胞在软琼脂培养10d左右可形成明显集落,其中10%、20%、30%含药血清及阳性组培养的细胞集落形成数目较阴性组明显减少(P<0.05),且该三组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),说明益气除痰方具有抑制A549细胞增殖的作用。(3)益气除痰方含药血清对A549细胞失巢凋亡的影响：1)琼脂糖凝胶电泳电泳实验中30%含药组(高剂量)及阳性组可见明显凋亡DNA Ladder条带,而阴性组、空白组、10%含药组(低剂量)、20%含药组(中剂量)均未明显特征性凋亡条带出现。说明益气除痰方含药血清可诱导A549细胞凋亡。2)流式细胞仪检测细胞凋亡：无论PI单染还是AV-PI双染,流式细胞仪检测结果均显示,益气除痰方含药血清对A549细胞具有明显的诱导凋亡的作用,低、中、高剂量组凋亡率分别为：PI单染8.40±1.67%、15.80±2.95%、27.4±0.96%(P<0.05,与阴性组比较：P<0.05,两两比较),但与阳性组39.00±1.11%相比,差异有统计学意义(P<0.05);AV-PI双染10.23±1.46%、16.30±0.96%、27.10±1.22%(P<0.05,与阴性组比较：P<0.05,两两比较),但与阳性组45.80±1.45%相比,差异有统计学意义(P<0.05)(4)益气除痰方诱导失巢凋亡中对PI-3K和MAPK信号传导通路相关蛋白P-akt、P-p38的影响：通过Western blot法对P-akt和P-p38蛋白的表达进行检测,结果显示低剂量组、中剂量组、高剂量组中,P-akt蛋白相对表达量分别为0.77、0.57、0.54,较阴性组明显降低,说明益气除痰方可能通过降低人肺腺癌A549细胞P-akt蛋白的表达而影响PI3K／akt信号传导通路的变化；而P-p38蛋白相对表达量分别为1.02、1.07、1.09,较阴性组未见明显变化,尚不能证明益气除痰方对MAPK信号通路上P-p38蛋白的表达有明显影响。结论本研究从临床上观察到益气除痰方能够调整T淋巴细胞亚群比例,提高CD3+、CD4+值及CD4+／CD8+比例,并能增强NK细胞活性,提高机体免疫力以增强抗肿瘤作用；同时益气除痰方含药血清体外具有抑制人肺腺癌A549失巢状态下的增殖及诱导失巢凋亡的作用,其诱导失巢凋亡的作用可能与降低PI3K／akt信号传导通路的P-akt蛋白相关,其更加深入的研究还有待继续。