背景：　　泛素（Ubiquitin，Ub）是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。泛素标记的蛋白质被输送到蛋白酶体进行降解。泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system，UPS）介导了细胞内80％以上蛋白的降解，不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等有重要的调控作用。泛素-蛋白酶体系统已经成为包括肿瘤在内许多疾病治疗的重要靶点。蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib）已经被美国FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等疾病，并取得了比较理想的治疗效果。硼替佐米的抗癌活性表明，针对泛素-蛋白酶体系统其它组份的药物有望成为治疗人类癌症的新药。泛素修饰系统一个很重要的特点，就是去泛素化酶（Deubiquitinases，DUBs）的存在导致修饰反应的可逆性。这种可逆性能维持细胞内单泛素化的稳态。去泛素化酶负责切割靶蛋白的泛素标签，因此去泛素化酶抑制能够引起大量泛素化蛋白的聚集。与蛋白酶体抑制剂引起泛素化蛋白聚集不同的是，大部分去泛素化酶抑制剂只针对特异的一种或者几种去泛素化酶，从而选择性的调控相关蛋白的变化，比蛋白酶体抑制剂更具有特异性和选择性，因此寻找去泛素化酶抑制剂对于肿瘤及其它疾病的治疗具有重要的应用价值。我们课题组从2006年起，在国家863计划和国家自然科学基金的资助下一直致力于蛋白酶体抑制剂和去泛素化酶抑制剂的筛选，希望能发现一类新的去泛素化酶抑制剂，为疾病的治疗提供新的手段。在研究过程中我们发现一类能够明显引起肿瘤细胞泛素化蛋白大量聚集的物质，包括外源性金属化合物金诺芬、CuPT和内源性物质胆红素。本课题将就以上物质对去泛素化酶的抑制展开研究，探讨金诺芬、CuPT、胆红素对去泛素化酶的调控作用及意义。　　方法和结果：　　运用肿瘤细胞系HepG2、MCF-7，稳定转染GFPu的HEK293细胞为模型，通过免疫印迹试验，我们发现金诺芬引起细胞泛素化蛋白大量聚集，蛋白酶体内源性底物P21、c-Jun和外源性底物GFP增多。但金诺芬对纯化20S、26S蛋白酶体活性和细胞26S蛋白酶体蛋白降解活性亚基没有明显影响。进而我们发现金诺芬对总的去泛素化酶活性和纯化去泛素化酶活性亚单位均没有明显作用，但可以抑制19S蛋白酶体的三个去泛素化酶亚基活性。计算机空间结构对接模型发现POH1、UCHL5和USP14与金诺芬存在空间对接的可能性，尤以POH1和UCHL5为甚。金诺芬还可以抑制26S蛋白酶体去泛素化酶亚基对K48、K63四聚体的解离，而且HA-UbVS竞争性结合试验发现金诺芬可以竞争性结合UCHL5和USP14。我们在基因水平用siRNA分别敲除POH1、UCHL5和USP14后可以减弱金诺芬的效应。进一步的研究发现，金诺芬可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，引起线粒体膜电位下降，内质网应激，NF-κB P65核转位减少，激活caspase系统。N-乙酰半胱氨酸（NAC）在逆转金诺芬诱导的肿瘤细胞凋亡的同时，还可以阻断金诺芬引起的泛素化蛋白聚集和ROS的生成。HPLC结果发现，NAC可以和金诺芬生成新的物质，从而在源头上阻断了金诺芬引起的泛素化蛋白聚集的效应。运用HepG2和MCF-7裸鼠移植瘤为模型，我们发现金诺芬可以抑制肿瘤组织生长，引起肿瘤组织泛素化蛋白和P21，c-Jun聚集增多，诱导肿瘤组织细胞凋亡。金诺芬抑制肿瘤组织生长与蛋白酶体底物聚集增多存在正相关。运用急性髓系细胞白血病（Acute myeloid leukemia, AML）病人的单核细胞和健康志愿者的全血单核细胞为模型，我们发现金诺芬能够聚集两种细胞泛素化蛋白，但选择性的诱导AML病人单核细胞凋亡。　　运用肿瘤细胞系HepG2和稳定转染GFPu的HEK293细胞为模型，通过免疫印迹试验，我们发现 CuPT引起细胞泛素化蛋白大量聚集和外源性底物 GFP增多，但效应浓度的CuPT对细胞26S蛋白酶体蛋白降解活性亚基没有明显作用。进而我们发现CuPT可以抑制总的去泛素化酶和纯化去泛素化酶亚单位活性，并且能够抑制19S蛋白酶体的三个去泛素化酶亚基活性。计算机空间结构对接模型发现POH1、UCHL5和USP14均与CuPT存在空间对接的可能性。CuPT还可以抑制26S蛋白酶体去泛素化酶亚基对K48、K63四聚体的解离，而且HA-UbVS竞争性结合试验发现CuPT可以竞争性结合UCHL5和USP14。我们在基因水平用siRNA分别敲除POH1、UCHL5和USP14后可以减弱CuPT的效应。进一步的研究发现，CuPT可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。NAC在逆转CuPT诱导的肿瘤细胞凋亡的同时，还可以阻断CuPT引起的泛素化蛋白聚集。HPLC结果发现，NAC可以和CuPT生成新的物质，从而在源头上阻断了CuPT引起的泛素化蛋白聚集的效应。运用AML病人的单核细胞和健康志愿者的全血单核细胞为模型，我们发现CuPT可以聚集细胞泛素化蛋白，诱导白血病病人和正常人单核细胞发生凋亡。　　运用不同的细胞系、瞬时转染GFPu或GFP-LC3的HepG2细胞和稳定转染GFPu的HEK293细胞为模型，通过免疫印迹试验，我们发现胆红素引起细胞泛素化蛋白大量聚集，但对外源性底物 GFP影响不明显。效应浓度的胆红素对纯化20S蛋白酶体和细胞26S蛋白酶体蛋白降解活性亚基没有明显作用。胆红素对总的去泛素化酶影响不明显，但可以抑制19S蛋白酶体的去泛素化酶亚基活性。HA-UbVS竞争性结合试验发现胆红素可以竞争性结合UCHL5和USP14。生理浓度胆红素对人白细胞、淋巴细胞以及中性粒细胞都具有明显的保护作用，可以延长这些细胞的寿命，而对人红细胞的寿命则没有影响。进一步的研究发现，胆红素可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，激活caspase系统，引起内质网应激，抑制自噬，但是胆红素引起泛素化蛋白聚集先于抑制自噬。运用 H22肝癌昆明小鼠移植瘤和P388腹水瘤昆明小鼠为模型，我们发现胆红素可以抑制H22肝癌肿瘤组织生长，但对P388腹水瘤小鼠生存时间没有明显的影响。　　结论：　　1.金诺芬能够抑制19S蛋白酶体的去泛素化酶活性发挥抗肿瘤作用。　　2. CuPT能够抑制细胞内总的去泛素化酶和19S蛋白酶体的去泛素化酶活性发挥抗肿瘤作用。　　3.胆红素能够抑制19S蛋白酶体去泛素化酶活性发挥抗肿瘤作用。