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研究目的:α7烟碱型乙酰胆碱受体(Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R)是目前已明确的在胆碱能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)中发挥关键作用的受体。腺苷受体A2A是腺苷受体中发挥抗炎和免疫抑制作用的主要亚型。青藤碱(Sinomenine,SIN)是治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)的临床常用药。实验室前期研究观察到SIN对AA模型大鼠的抗关节炎作用可被α7n ACh R特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(Alpha bungarotoxin,α-BTX)抑制,提示SIN通过作用于α7n ACh R对大鼠佐剂性关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AA)模型发挥抗关节炎作用。在细菌内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的小鼠内毒素血症模型中,发现青藤碱发挥抗炎作用时能调节A2A表达。本研究采用大鼠AA模型,首先分析SIN对A2A表达的影响以及A2A表达变化与AA发病进程的关系,研究SIN发挥抗关节炎作用与A2A表达变化之间的关系;进一步研究SIN对成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗增殖、抗炎作用中对A2A表达的影响及其与靶向α7n ACh R的关系,为阐明SIN抗关节炎机制提供实验依据。研究方法:1.SIN对AA模型大鼠中A2A表达的影响选用雄性SD大鼠,100-120g,尾根部皮内注射完全弗氏佐剂建立大鼠AA模型,分组为对照组、模型组、SIN组、烟碱(Nicotine,Nic)组、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组,连续30天灌胃给药(1次/天)后取肝脏、脾脏和滑膜。采用Western blot检测各组肝脏A2A蛋白表达,免疫组化检测脾脏和滑膜组织中A2A表达,初步观察在AA模型大鼠中,SIN对A2A表达的影响。2.AA模型发病进程中A2A表达变化造模方式同上,分组为对照组、模型组,SIN组、MTX组,灌胃给药,1次/天,Western blot检测对照组和模型组大鼠不同时间点(第0、12、18、24、30d)滑膜、肝脏A2A表达变化。在A2A表达变化峰值时间点,检测SIN、MTX对A2A表达的影响。3.免疫荧光初步观察SIN对FLS中A2A表达的影响分离造模后30天模型组大鼠的滑膜组织,采用组织块法培养原代FLS,流式细胞术鉴定FLS,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和LPS刺激FLS诱导体外增殖或炎症模型,免疫荧光初步观察SIN对FLS中A2A蛋白表达的影响。4.SIN对TNF-α诱导的FLS增殖的影响及α-BTX对SIN调节A2A表达的拮抗作用MTT法观察不同浓度SIN(100μM、200μM和400μM)对TNF-α诱导的FLS增殖的影响;RT-PCR观察A2A m RNA表达变化;ELISA检测细胞培养上清中促炎性细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1)水平;免疫荧光观察α-BTX对SIN调节A2A表达的拮抗作用。5.沉默α7n ACh R观察SIN对LPS诱导的FLS的抗炎作用及A2A表达的影响采用LPS刺激FLS诱导体外炎症模型,比较si RNA沉默α7n ACh R和非沉默组之间SIN对炎症因子的释放和A2A表达的影响。WB检测α7n ACh R蛋白表达,验证沉默效果;ELISA检测细胞培养上清中促炎性细胞因子MCP-1和IL-6含量变化,WB检测A2A蛋白表达变化。研究结果:1.SIN对AA模型大鼠A2A表达的影响与对照组相比,肝脏组织模型组A2A表达降低,SIN、Nic和MTX均能够明显上调A2A的表达。免疫组化结果显示,脾脏和滑膜组织中A2A表达趋势与肝脏一致。2.AA模型发病进程中A2A表达变化在AA大鼠发病进程中,WB结果显示:0-30d模型组滑膜和肝脏中A2A蛋白表达呈现出先降低后逐渐升高的动态变化,18d为大鼠AA模型炎症最高峰,A2A蛋白表达最低,与RA病程发展呈负相关。在18d时,与模型组对比,SIN和MTX均能够明显升高A2A表达。3.SIN对FLS中A2A表达的影响与靶向α7n ACh R的关系免疫荧光结果显示:与对照组相比,TNF-α和LPS组A2A表达明显降低,SIN组A2A表达升高;RT-PCR结果显示:与对照组相比,TNF-α组A2A表达降低;与TNF-α组相比,SIN组(200μM和400μM)A2A表达升高,且具有统计学差异(P<0.05);使用α7n ACh R特异性拮抗剂及沉默α7n ACh R后,免疫荧光和WB结果显示SIN对A2A的上调作用被明显减弱。α7n ACh R沉默明显减弱了SIN对促炎性细胞因子MCP-1和IL-6的抑制作用。结论:1.体内实验证明SIN发挥抗炎作用的同时能上调肝脏、脾脏、滑膜中异常降低的A2A的表达。2.A2A表达水平与大鼠AA模型发病进程呈负相关。3.FLS体外实验表明,FLS增殖和炎症水平升高时,A2A表达降低,SIN发挥抗增抗炎作用时能上调A2A表达。4.SIN通过作用于α7n ACh R抑制炎症因子释放、上调A2A表达,从而发挥抗炎作用。