研究背景与目的早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency,POI,又称卵巢早衰)是指女性在40岁前原发性或继发性闭经,其持续发生时间至少维持4个月,并伴发血清雌激素(Estradiol,E2)水平降低,促卵泡生成激素(Follicle stimulating hormone,FSH)水平显著增高。目前认为POI的病因多样,包括基因突变、自身免疫病、感染因素、代谢因素、医源性因素、环境污染、心理因素等。由于雌激素水平降低、促卵泡生成激素水平的增高,常导致一系列临床并发症状,包括:不孕不育、心血管疾病,骨质疏松、泌尿神经系统疾病和精神症状,严重影响了女性正常生活。顺铂(Cisplatin,CDDP)是一种临床上常用的肿瘤化疗药物,可抑制DNA复制,属于细胞毒性药物,主要破坏增殖的颗粒细胞和间质细胞,进而导致卵巢功能减退,甚至POI。已有少量文献报道顺铂诱导的卵巢功能损害与内质网应激相关,但其发生机制尚未明确。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞中一种重要的细胞器。内质网在细胞内参与蛋白质的折叠和加工、脂质合成与分泌等。当细胞内发生蛋白折叠错误、感染、PH值改变、低氧或Ca2+平衡失调时,可激发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。内质网应激的发生可导致未折叠蛋白反应(Unfoldedprotein response,UPR)激活,识别并清除这些错误折叠的蛋白,从而维持内质网和内环境的稳定,是机体对外界或内在刺激发生时的一种自我保护机制。当发生过强或过于持久的内质网应激时,可导致细胞凋亡。UPR主要功能为:(1)诱导内质网应激蛋白的表达,如Heat shock 70 kDa protein 5(HSPA5也称GRP78 或 Bip)和 Heat shock protein HSP 90-beta(HSP90AB1 也称 HSP84 或TSTA)。(2)抑制蛋白质的翻译,当HSPA5与内质网中未折叠蛋白结合后即和PERK分离,从而激活了 PERK信号通路,促进真核蛋白翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2a subunit,e1F2a)磷酸化修饰,导致核糖体蛋白合成减少。(3)过强的内质网应激诱导CHOP表达从而导致细胞凋亡。4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)能下调ERS相关蛋白,因而可作为内质网应激的抑制剂来抑制内质网应激,在本实验中被用于探究内质网应激与卵巢损伤的关系。自噬是一种细胞内降解系统,当细胞面临代谢应激时,通过溶酶体途径,降解受损或老化的蛋白质或细胞器,在调节细胞内稳态方面发挥着重要作用。过强的细胞自噬可损害细胞,引发凋亡。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenin,3-MA)可作为一种自噬抑制剂降低自噬水平,因而被应用到我们的实验当中来探究自噬与顺铂诱导卵巢损伤之间的关系。近年来有关内质网应激和自噬凋亡间的关系已经成为研究热点,但其具体的相互作用关系还有待进一步的探索和验证。本课题通过建立顺铂诱导小鼠POI模型及体外顺铂刺激卵巢颗粒细胞(Granule cells,GCs)实验模型,运用组织学及细胞分子生物学方法,从分子、细胞与个体水平阐述内质网应激、自噬和凋亡在顺铂诱导的卵泡发育及卵巢功能障碍中的作用机制。内质网应激抑制剂4-PBA的使用缓解了顺铂诱导的POI,为保护由顺铂等化疗药物导致的卵巢损伤提供新的实验依据和潜在的治疗靶点。研究方法1、应用顺铂处理C57BL/6J小鼠,建立小鼠POI模型。3、通过实时定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测顺铂诱导的小鼠卵巢组织HSPA5和HSP90入B1的mRNA变化情况,western blot技术进一步分析卵巢组织HSPA5和HSP90AB蛋白变化情况。4、在KGN颗粒细胞和COV434颗粒细胞上,通过western blot、流式检测siRNA、顺铂、4-PBA、3-MA处理后分析细胞内质网应激、自噬和凋亡水平。5、通过DALgreen检测4-PBA、3-MA对顺铂诱导KGN颗粒细胞发生自噬水平的影响。6、生理盐水、4-PBA、3-MA与顺铂共同处理C57BL/6J小鼠1天、3天和7天后,通过HE染色分析小鼠卵巢组织形态,统计初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡和闭锁卵泡数量。7、通过TUNEL检测小鼠卵泡中颗粒细胞细胞凋亡情况并统计凋亡细胞数。8、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对处理7天后的小鼠血清进行生化分析,检测小鼠E2和FSH激素的变化情况。研究结果1、顺铂诱导小鼠POI模型中卵巢HSPA5和HSP90AB1水平显著降低为了探讨顺铂诱导POI的作用机制,使用iTRAQ蛋白质组学技术对顺铂处理后的小鼠卵巢组织进行蛋白分析。筛查的蛋白共5668种,与对照组相比,上调1.5倍及以上的蛋白214种,下调1.5倍以上的蛋白180种。通过生物信息学进一步分析这些显著变化的蛋白,发现顺铂处理后的内质网应激相关的蛋白HSPA5和HSP90AB1分别下调了 2.5倍和2.3倍。为进一步验证iTRAQ的结果,我们通过实时定量PCR技术,检测顺铂处理后小鼠卵巢内mRNA水平的变化情况。结果同样证明实验组的HSPA5和HSP90ABlmRNA水平明显低于对照组,p值分别为p=0.003和p=0.047。western blotting进一步证实顺铂处理7天后的卵巢组织HSP90AB1和HSPA5的蛋白表达水平较对照组明显降低。这些结果说明内质网应激与顺铂诱导的POI强烈相关。2、通过siRNA敲低内质网应激相关基因后可降低细胞自噬和凋亡水平首先通过免疫荧光技术,用抗-HSPA5抗体和抗-HSP90AB1抗体在小鼠卵巢石蜡组织切片上进行蛋白定位检测,发现其主要在颗粒细胞的细胞质中表达,并且凋亡颗粒细胞中的表达强度较正常颗粒细胞明显增强。可推测内质网应激的发生主要在卵巢颗粒细胞上,因而在后续的细胞实验中,我们选用颗粒细胞作为体外细胞实验对象。为了在体外细胞实验中找到顺铂适宜处理剂量与处理时间,我们设计了顺铂浓度梯度和时间梯度实验。在KGN颗粒细胞中,以0、2、5、10、25、50μM的顺铂处理24小时,然后收集细胞,通过western blot验证HSP90AB1和HSPA5的蛋白表达情况。我们发现,HSP90AB1和HSPA5的蛋白水平在顺铂处理浓度为50μM时,表达量明显降低。同样在KGN颗粒细胞中,以50μM的顺铂处理浓度处理0、4、8、16、24小时,然后收集细胞,通过western blot验证HSP90AB1和HSPA5的蛋白表达情况。发现HSP90AB1和HSPA5的蛋白水平在顺铂处理4小时后开始上升,处理24小时后明显下降。为了探究HSP90AB1和HSPA5对顺铂刺激下颗粒细胞自噬和凋亡的影响,我们首先用Hsp90ab1和Hspa5的siRNA转染KGN颗粒细胞和COV434颗粒细胞并作为实验组,以空载siRNA(NC)为对照组,转染48小时后,用50μM的顺铂处理0、8、16、24小时,然后通过western blot验证颗粒细胞内质网应激、自噬和凋亡的表达情况。与对照组相比,实验组各个时间段的HSP90AB1和HSPA5蛋白水平表达都明显降低,证明siRNA转染敲低基因有效,内质网应激水平降低。P62和ATG12作为检测自噬水平的标志蛋白,与对照组相比,P62蛋白的轻度上升和ATG12表达降低,证明内质网应激相关基因被敲低后降低的内质网应激水平可降低自噬蛋白表达水平。而PARP作为凋亡相关的标志蛋白,可被凋亡蛋白caspase剪切成为cleaved-PARP,并随凋亡的增强而表达增多。实验组中的cleaved-PARP蛋白水平较对照组明显降低,证明抑制内质网应激可降低凋亡蛋白表达水平。3、4-PBA可缓解顺铂诱导颗粒细胞发生的内质网应激,并降低自噬和凋亡水平4-PBA作为一种内质网应激抑制剂,对内质网应激的影响理论上与Hspa5和Hsp90ablsiRNA处理结果相似。在KGN颗粒细胞和COV434颗粒细胞中,以上述顺铂的处理浓度,加入5mM的4-PBA后,处理0、4、8、16、24小时,收集细胞通过western blot验证到HSP90AB1和HSPA5蛋白表达水平较单独使用顺铂组降低,依旧可以看出在单位时间处理下的蛋白表达量梯度变化,同样在处理4小时后上升,24小时后下降。自噬标志蛋白P62和ATG12表明在顺铂处理8-16小时开始增强,而凋亡相关蛋白cleaved-PARP在顺铂处理后16-24小时表达增多。从以上实验结果中可以推测:顺铂可激活颗粒细胞中的内质网应激,增强的内质网应激可激发自噬,最终诱发凋亡,增强的自噬和凋亡可降低内质网应激水平。为进一步验证4-PBA对顺铂诱发KGN颗粒细胞凋亡的影响,我们以相同的药物处理浓度处理24小时,并使用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,发现在顺铂合并4-PBA共同处理,较单独使用顺铂处理的细胞凋亡率降低,证明4-PBA可以缓解顺铂诱导的颗粒细胞凋亡。4、3-MA可降低顺铂诱导的颗粒细胞自噬水平,但对内质网应激和凋亡无明显作用通过免疫荧光技术,用抗-LC3抗体在小鼠卵巢石蜡组织切片上进行定位检测,与内质网应激相关蛋白表达相似,LC3蛋白主要在颗粒细胞的细胞质中表达,凋亡的颗粒细胞中LC3表达强度较正常颗粒细胞明显增强。可推测自噬的发生主要在卵巢颗粒细胞中。首先用DALGreen荧光染料染颗粒细胞,DALGreen是一种可以通过与自噬小体结合发出绿色荧光的染料。将实验分为四个组,分别为对照组,即只加DALGreen荧光染料组,实验组在加DALGreen荧光染料的基础上,再分别用顺铂、顺铂+4-PBA、顺铂+3-MA(5mM)处理。实验结果显示:无论从细胞流式还是共聚焦显微镜上观察细胞的荧光强度表达强大来看,4-PBA和3-MA都可以降低顺铂诱导的自噬水平,与对照组相比具有统计学差异,但4-PBA降低自噬的作用较3-MA更强。统计在共聚焦显微镜下观察到的阳性细胞率,与顺铂组相比,对照组和加了 4-PBA药物处理组的阳性细胞明显降低,并具有统计学差异(p值分别为p=0.024和p=0.011)。在KGN颗粒细胞和COV434颗粒细胞中,在述顺铂的处理浓度基础上加入3-MA,将3-MA浓度调整为5mM,处理0、4、8、16、24小时,收集细胞通过western blot验证到P62和ATG12代表的自噬水平在顺铂合并3-MA处理组中较单纯使用顺铂时降低,尤其是ATG12更为明显,但内质网应激相关蛋白HSP90AB1和HSPA5和凋亡相关蛋白cleaved-PARP在两组间的表达并未表现出明显差异。为进一步探讨3-MA对顺铂诱发KGN颗粒细胞凋亡的影响,我们以上述药物处理浓度处理KGN颗粒细胞24小时,并使用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,发现顺铂合并3-MA共同处理组与单独使用顺铂处理的细胞凋亡水平并无统计学差异,证明3-MA无明显缓解顺铂诱导的颗粒细胞凋亡的作用,进而推断,自噬对细胞内质网应激和凋亡并无直接促进作用。5、4-PBA和3-MA在体内对顺铂诱导POI的保护作用我们比较了 4-PBA和3-MA在体内对CDDP诱导的卵巢损伤的保护作用。雌性小鼠用CDDP与4-PBA或3-MA联合处理1,3或7天。组织形态学检查显示,在第1天的所有组中卵泡在不同发育阶段的形态相似。然而,在第3天,CDDP治疗组的健康卵泡较少(尽管不显著),并且比生理盐水处理组的闭锁卵泡明显增多(P<0.05)。4-PBA和3-MA可轻度减少顺铂诱导的滤泡闭锁。到第7天,更长时间的顺铂刺激严重破坏健康卵泡并导致过度闭锁卵泡(均P<0.01),因为和卵泡一样,更多次级卵泡受损,而初级卵泡不易受到影响。因此,顺铂优先靶向破坏成熟和发育中的卵泡而非未发育的卵泡,导致滤泡储备的过早衰竭。4-PBA通过保存健康卵泡,减少卵泡闭锁,明显缓解顺铂诱导的卵泡丢失。与此相一致的是,TUNEL检测显示顺铂诱导的颗粒细胞凋亡在第3天达到峰值(P<0.01),4-PBA可显著降低顺铂诱导的颗粒细胞凋亡(P<0.05),但3-MA无明显缓解作用(P>0.05)。到第7天,CDDP组的颗粒细胞凋亡强度下降,而4-PBA可略微减少凋亡细胞的数量。与组织学结果一致,用ELISA检测激素水平结果显示,顺铂处理7天后,血浆中E2含量明显降低,临床上诊断POI最终要的生化指标FSH水平明显升高(P<0.01)。4-PBA可抑制顺铂诱导的FSH增加,但不降低E2水平,而3-MA的使用对顺铂导致的这些变化可忽略不计。此外,卵巢蛋白的免疫印迹分析显示,4-PBA可在体内降低顺铂引起的ATG12,HSPA5,HSP90AB1 和 cleaved-PARP 的蛋白质水平升高。尽管 3-MA可降低ATG12的蛋白质水平,但对顺铂诱导的cleaved-PARP增加并无明显缓解作用。这些结果共同支持缓解内质网应激可减轻顺铂诱导的颗粒细胞凋亡和卵巢损伤的观点。综上所述,顺铂可以破坏卵巢内卵泡的发育,其机制可能与顺铂诱导卵巢内质网应激相关。内质网应激可激发细胞自噬,过强或持续的内质网应激最终可导致细胞凋亡。在卵巢组织中,主要表现为闭锁卵泡增多,健康成熟的卵泡减少,伴随颗粒细胞凋亡增多,FSH升高,E2降低等POI相关症状。结论1、顺铂可诱导小鼠体内内质网应激相关基因Hspa5和Hsp90ab1的表达降低;2、Hspa5和Hsp90ab1在有顺铂刺激条件下的颗粒细胞中发挥重要作用,敲低后降低细胞内质网应激、自噬和凋亡水平;3、内质网应激抑制剂4-PBA可降低顺铂诱导颗粒细胞发生的内质网应激,自噬和凋亡水平;4、自噬抑制剂3-MA可降低顺铂诱导的颗粒细胞自噬水平,但对内质网应激和凋亡无明显作用;5、4-PBA可缓解顺铂诱导的小鼠卵巢损伤。