目前,用于邻苯二酚类物质检测的酶生物传感器中涉及到的酶主要为酪氨酸酶、辣根过氧化物酶、漆酶等,然而这些酶的底物范围宽泛,可催化多种酚类化合物发生反应,导致它们在混合体系中实现对邻苯二酚类物质的选择性检测相当困难。因此,该类传感器的发展方向在于筛选可作用于邻苯二酚类物质的特异性酶构建生物传感器,以期满足环境监测和生物毒理等领域的需求,实现高选择性、高灵敏性、高稳定性的邻苯二酚类物质检测。芳香化合物降解过程中的关键开环断裂酶：外二醇双加氧酶和内二醇双加氧酶,是一类能够以邻苯二酚类化合物为底物进行开环断裂反应的酶,与上述各类酶相比,这类加氧酶对邻苯二酚类化合物的特异性更强,选择性更好。本论文旨在将一种外二醇双加氧酶——2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶(BphC)粗酶提取液,用于邻苯二酚类物质的传感器制备,实现邻苯二酚类物质的特异性、灵敏迅速检测,并为其它酶在传感器制备中的应用提供依据,主要研究内容如下：选用两步统计学设计方法对影响重组Escherichia coli BL21(DE3)中BphC表达的因素进行筛选和优化。首先,通过N=12的Plackett-Burman实验设计,对基因工程菌培养过程中十个主要因素进行筛选,确定种液培养基pH、种龄、发酵液接种量、诱导温度是影响BphC表达的四个主要因素。随后,利用表面响应法设计了30组实验对这四个因素进行了考察,确定其最佳组合,结果为：种液pH为6.5；种龄9h；大瓶接种量为0.95%；诱导温度为35℃。在此最佳条件下,获得的BphC酶活力最高可达0.59U/mg蛋白,约为优化前酶活的三倍。SDS-PAGE结果与优化实验结果相符,验证了模型的准确性和稳定性。优化后获得的BphC表达量大,对邻苯二酚具有很高的酶活力,用于后续制作邻苯二酚酶生物传感器可大大节省工作量,为提高BphC在酶生物传感器中的检测性能垫定了基础,对开展实验研究及实际应用具有重要意义。考察BphC作为敏感元件用于电化学酶生物传感器的可行性。分别选用ZnO纳米棒、Ti02纳米管、不同掺杂的聚苯胺(PNAI)材料、ZnO溶胶凝胶以静电结合法、吸附法、交联法、包埋法等常规固定方法对BphC在电极上进行固定。研究结果表明BphC粗酶液可以在电极上作为敏感元件用于电化学检测,但上述几种修饰酶电极的方法,其稳定性及灵敏性远不能满足实际应用的需要：ZnO纳米棒修饰锌片电极上的BphC采用静电结合法与电极结合不牢固,易脱落,制备的酶电极性能不稳定,不利于进一步检测；Ti02纳米管/BphC修饰Ti片电极对底物的检测信号不明显,不适合进一步应用；与离子液体及聚邻氨基酚掺杂的PANI相比,未掺杂的PANI修饰电极能很好地保持BphC的酶活且可以用于邻苯二酚检测,但此类方法性能极不稳定；ZnO溶胶凝胶修饰BphC酶电极能很好地保持BphC的酶活,但酶膜易干裂,且电化学重复性较差。因此,改进现有的酶固定化方法和尝试新的有效的酶电极制备方案仍需进一步研究。制备BphC酶生物传感器,用于邻苯二酚的电化学检测。固定在聚乙烯醇(PVA)-SiO2凝胶中的BphC能很好地保持活性,制备的酶电极对邻苯二酚表现出很好的电化学响应信号。室温条件下,该酶生物传感器对邻苯二酚标准液的工作曲线线性范围为0.002-0.8mM,相关系数为0.9978,灵敏度为1.268mA/(mM·cm2),检出限为0.428μM (S/N=3)。在苯酚和邻苯二酚共存体系中,BphC酶电极对邻苯二酚有很好的选择性,与裸玻碳电极相比,能将邻苯二酚与苯酚的响应信号较好地分离。该酶生物传感器的制备,为生物降解中的关键酶在环境监测的应用奠定了基础。建立BphC-CdTe量子点(QDs)荧光传感体系,实现对邻苯二酚及2,3-二羟基联苯的检测。该体系利用内滤效应引起的量子点荧光猝灭,成功地将BphC这一类芳香化物好氧降解过程中的加氧酶用于荧光检测。建立的BphC-QDs体系中量子点表面不需修饰,BphC不需固定,且能保持较好的活性。BphC-QDs体系对邻苯二酚和2,3-二羟基联苯的检测性能良好,对邻苯二酚和2,3-二羟基联苯的检测限分别可达到0.021μM和2μM,效果较好。BphC-QDs体系对邻苯二酚和2,3-二羟基联苯的选择性较好,苯酚、间苯二酚、对苯二酚的存在,对这两种物质单独检测均没有影响,但当邻苯二酚和2,3-二羟基联苯同时存在时,互相有干扰。以基因工程菌中的粗酶为模板原位合成金纳米簇(Au nanoclusters, AuNCs)荧光材料,并结合合成的AuNCs在碱性条件下较稳定的特点以及多巴胺在碱性条件下易氧化成醌类的特点,提出一种基于AuNCs荧光猝灭机制的pH敏感型多巴胺检测方法。pH、蛋白量、氯金酸量均对BphC-AuNCs的合成有较大影响,温度变化对BphC-AuNCs的荧光稳定性影响不大。本研究合成的五种粗酶-AuNCs (BphAB-AuNCs、BphC-AuNCs、 BphD-AuNCs、MfphA-AuNCs和E. coli-AuNCs)荧光量子产率均高于相同条件下以牛血清蛋白为对照合成的AuNCs荧光产率。碱性条件下,多巴胺对五种AuNCs荧光均有猝灭效应,且随着多巴胺浓度增强猝灭效应增强。