【摘 要】
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目的:我们前期研究已经证实肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)在缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)肾损伤中具有抑制肾小管上皮细胞凋亡作用,但其具体
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目的:我们前期研究已经证实肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)在缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)肾损伤中具有抑制肾小管上皮细胞凋亡作用,但其具体机制尚未完全阐明。本研究采用ALR-EGFP-3FLAG表达融合蛋白慢病毒载体转染人肾小管上皮细胞(HK-2)的方法,构建稳定过表达ALR的人肾小管上皮细胞株;观察体外缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)处理对HK-2细胞线粒体动力学(mitochondrial dynamics)相关蛋白表达的影响,并探讨过表达ALR对HR诱导HK-2细胞线粒体动力学的影响及作用机制。方法:将特异性过表达人23kD ALR的慢病毒Lv-ALR(ALR-EGFP-3FLAG)转染HK-2细胞,慢病毒Lv-vector转染HK-2细胞作为对照,通过观察EGFP荧光和利用抗Flag抗体通过Western Blot检测HK-2细胞中23kD ALR的蛋白表达情况对HK-2细胞进行筛选处理;采用Hank’s平衡盐溶液结合缺氧复氧(HR)的方法对HK-2细胞进行处理,模拟体内IR肾损伤模型;实验分为Normal组、IR组、Lv-vector+IR组、Lv-ALR+IR组。缺氧6h复氧12h刺激后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。STRING v10预测蛋白-蛋白相互作用网络。Western Blot检测线粒体分裂关键蛋白Drp1、p-Drp1、MTFP1及相关信号通路蛋白mTOR、p-mTOR、4E-BP1、p-4E-BP1的蛋白水平。Western Blot检测线粒体融合关键蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达情况。结果:荧光显微镜观察转染细胞GFP荧光表达丰度,感染效率约80%纳入后续检测。Western Blot检测显示,与Lv-vector组比较,Lv-ALR组细胞23 kD ALR蛋白得到有效表达(P<0.05),与Lv-vector+IR组比较,Lv-ALR+IR组23 kD ALR蛋白同样有效表达(P<0.05);在H/R处理后6、12、24小时线粒体分裂关键蛋白Drp1表达逐渐上调,于H6R12达峰值,且H6R24仍处于较高水平;流式细胞仪检测显示过表达ALR可抑制H/R诱导的HK-2细胞凋亡;与Lv-vector+IR组比较,Lv-ALR+IR组中Drp1和MTFP1表达均明显下调(P<0.05),并且过表达ALR也使p-Drp1 Ser637激活;与Lv-vector+IR组比较,Lv-ALR+IR组中线粒体分裂相关信号通路蛋白p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1比值明显增高(P<0.05);线粒体融合关键蛋白OPA1表达水平上升(P<0.05),而Mfn1、Mfn2表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:过表达23kD ALR可通过抑制线粒体分裂和促进线粒体内膜融合对缺氧复氧处理肾小管上皮细胞线粒体具有保护作用,从而抑制肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾IR损伤;其抑制线粒体分裂的作用途径与活化mTOR/4E-BP1信号通路有关。
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