骨关节炎是世界性的公共健康问题,全球70岁以上人群的发病率约为40%。该病不仅会引起疼痛、关节畸形及功能障碍,还会出现代谢综合征的表现,全因死亡率升高。骨关节炎不仅仅是磨损性疾病,更是一种炎症性疾病。慢性炎症引起的关节软骨不同程度的丢失,是骨关节炎的核心病理变化。IL-17是一种重要的炎症细胞因子,通过诱导其他促炎因子的释放、增加中性粒细胞的趋化、诱导软骨产生一氧化氮合酶和基质金属蛋白酶、刺激滑膜细胞降解酶的活性等方式,参与了关节软骨的炎症和破坏。近来报道,IL-17在骨关节炎关节液和滑膜中的表达水平均增高且与疾病的严重程度相关,软骨细胞IL-17受体含量升高,提示IL-17及受体参与了骨关节炎的关节局部炎症。研究显示,IL-17是通过其信号通路来发挥生物学效应:IL-17与靶细胞膜特异性受体IL17RA和IL17RC结合,通过胞内信号传导分子ACT1和TRAF6,最终激活NF-κB。然而,在骨关节炎的关节软骨中,IL-17信号通路整体的表达和活化情况尚不清楚。表观遗传调控机制在骨关节炎的发病中具有重要作用,其中DNA甲基化与炎性疾病关系密切。骨关节炎的全基因组甲基化研究鉴定出的差异甲基化位点或区域多富集在免疫或炎症相关的基因上。靶向DNA甲基化分析发现,骨关节炎的关节软骨或者分离出的软骨细胞TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8和leptin基因启动子或增强子特定部位的去甲基化与这些基因表达的增加相关。有研究证实老年视网膜黄斑变性中IL17RC表达增高受基因启动子区域低甲基化的调节。但是,DNA甲基化在骨关节炎关节软骨IL-17信号通路的基因表达和活化中的作用,目前尚未见相关报道。[研究目的]1.考察骨关节炎关节软骨IL-17信号通路关键蛋白的表达及NF-κB通路的活化情况,探讨IL-17信号通路失衡在骨关节炎软骨炎症中的作用。2.评估骨关节炎关节软骨中IL-17信号通路关键基因的DNA甲基化状态,分析其对基因表达的影响及调控作用。3.在体外培养的软骨细胞中观察去甲基化药物5-Aza-dC对IL-17信号通路关键基因DNA甲基化状态、基因表达的影响,并探讨5-Aza-dC对软骨细胞产生细胞因子和趋化因子能力的影响。[研究方法]1.以膝骨关节炎病变区域关节软骨为实验组,非病变区域关节软骨为对照组。应用ELISA检测骨关节炎患者关节液中IL-17的含量。应用real-time PCR、western blotting及IHC等方法检测实验组和对照组关节软骨IL-17信号通路的表达情况,应用蛋白芯片技术,进一步观察NF-κB通路的活化程度,深入探讨IL-17信号通路和NF-κB通路的表达及活性失调在骨关节炎软骨炎症中的作用。2.采用革靶向捕获甲基化二代测序技术(MethylTarget-seq),通过IlluminaMiseq平台定量评估膝骨关节炎关节软骨中IL-17信号通路关键基因的DNA甲基化状态。共检测了 IL17RA、IL17RC、ACT1(TRAF3IP2)、TRAF6 和 RELA(p65)这 5 个基因转录起始点附近的9个CpG岛,共256个CpG位点,分析DNA甲基化对基因表达的调控作用。3.采用酶消化法分离、培养并鉴定骨关节炎膝关节软骨细胞。在软骨细胞的体外培养中,给予去甲基化药物5-Aza-dC进行干预,应用靶向捕获甲基化二代测序技术检测IL-17信号通路关键基因DNA甲基化水平的变化,real-time PCR考察目的基因mRNA的表达,应用CBA法检测培养上清中炎症因子和趋化因子的变化。分析5-Aza-dC能否改变IL-17信号通路基因的DNA甲基化状态以及基因的表达,评估5-Aza-dC潜在的治疗作用及临床应用价值。[研究结果]1.IL-17信号通路关键蛋白的表达和活化在骨关节炎软骨炎症中的作用(1)首先,我们对骨关节炎患者(n=20)和对照组关节损伤患者(n=20)膝关节液中IL-17的含量进行了检测。ELISA结果显示:骨关节炎患者关节液中IL-17含量较对照组显著升高,且关节液中IL-17的水平明显高于循环中的含量。提示骨关节炎患者的慢性炎症更多地局限在关节局部,IL-17在关节腔局部过表达。(2)其次,取骨关节炎病变区域关节软骨为实验组(n=26),非病变区域关节软骨为对照组(n=26),检测IL-17信号通路中跨膜受体IL17RA、IL17RC,信号传导分子ACT1、TRAF6,核因子NF-κB(RELA/p65)的表达。实时荧光定量PCR结果显示,骨关节炎病变区域软骨中IL17RA、ACT1、TRAF6和RELA/p65mRNA表达明显升高。免疫组化和蛋白免疫印迹结果显示,骨关节炎病变区域软骨中,IL17RA、IL17RC、ACT1、RELA/p65的蛋白表达量明显高于非病变区。(3)进一步,我们观察了骨关节炎关节软骨NF-κB炎症通路的表达和活化情况。蛋白芯片结果显示,病变区域软骨组织中NF-κB信号通路的41种蛋白质和4种丝氨酸或酪氨酸磷酸化位点的表达升高。其中LTBR/TNFRSF3、IL-1RI、IKK1/IKKα/CHUK、BCL10这4个蛋白表达明显升高,具有统计学意义。这提示骨关节炎病变软骨中NF-κB信号通路是过度表达和活化的。2.骨关节炎关节软骨中IL-17信号通路关键基因DNA甲基化状态(1)首先,对IL-17信号通路上5个关键基因转录起始位点(Transcription start site,TSS)附近的CpG岛进行预测。设置条件为:Observed/Expected ratio>0.60,PercentC+PercentG>50.00%,Length>200bp。查找条件为:符合条件的TSS前2K至第一外显子下游1K区域,且多重剪切方式取并集统计。按照上述条件,5个目标基因共预测到9个CpG岛,共包含256个CpG位点。(2)其次,取膝骨关节炎病变区域关节软骨为实验组(n=40),非病变区域关节软骨为对照组(n=40),采用靶向捕获甲基化二代测序技术对目的区域进行检测,得到单碱基精度的DNA甲基化图谱。在256个CpG位点中,共发现26个差异甲基化CpG位点,其中21个位点的甲基化比例较对照组降低,5个位点的甲基化比例升高。在IL-17信号通路中,信号传导分子ACT1是差异甲基化基因,骨关节炎病变软骨中ACT1启动子的甲基化比例较非病变区域明显降低。DNA甲基化与基因mRNA表达的相关性分析发现,TRAF6的差异化CpG位点(+383 bp)甲基化水与TRAF6 mRNA的表达呈负相关。ACT1 6个差异甲基化位点的甲基化比例与mRNA表达呈负相关,ACT1启动子区域的甲基化水平与mRNA表达同样呈负相关。这些结果提示,IL-17信号通路基因DNA甲基化水平的降低会上调这些基因的表达,从而参与了骨关节炎的软骨炎症和发病机制。3.5-Aza-dC对骨关节炎软骨细胞IL-17通路基因甲基化状态及基因表达的作用(1)首先,采用酶消化法分离、培养骨关节炎软骨细胞。通过甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色,对软骨细胞的表型进行鉴定,证明该方法能获得高纯度的人关节软骨细胞。(2)其次,在软骨细胞体外培养过程中,予以不同浓度(10ng/ml,50ng/ml)IL-17A刺激用以模拟关节局部炎症环境。通过CBA法检测软骨细胞分泌炎症介质的能力,结果显示:在IL-17A的刺激作用下,软骨细胞分泌大量细胞因子和趋化因子,培养上清中炎症细胞因子IFNα,IFNγ,MCP-1,IL-6,IL-12p70,IL-18,IL-23,IL-33,趋化因子CXCL9,CXCL5,CCL20,CXCL1均较未刺激组明显升高。(3)此外,对单层培养的软骨细胞予以去甲基化药物5-Aza-dC进行干预,观察药物对于基因DNA甲基化和基因表达的影响。MethylTarget-seq结果显示:5-Aza-dC干预3d时IL17RA、IL17RC、TRAF6的甲基化水平存在差异,5d时IL17RA和RELA出现不同程度和趋势的差异化位点。Real-time PCR结果显示:5-Aza-dC干预后IL17RA、IL17RC、ACT1、TRAF6mRNA的表达有所升高,其中IL17RC和ACT1 mRNA水平明显高于对照组。CBA结果显示:软骨细胞分泌炎症介质的能力降低,培养上清中细胞因子IFNα,MCP-1,IL-6,IL-10,IL-12p70,IL-18,IL-23,IL-33,趋化因子CCL2,CXCL5,CCL20较对照组明显降低。[主要结论]1.膝骨关节炎关节液中IL-17升高,病变区域关节软骨IL-17信号通路关键蛋白(IL17RA、IL17RC、ACT1、TRAF6和RELA)过度表达和活化,在关节软骨炎症具有重要作用。2.骨关节炎病变软骨IL-17信号通路关键基因呈低甲基化状态,上调了相关基因的表达,从而参与了 OA软骨炎症的发生和调控。3.影响甲基化药物5-Aza-dC能改变软骨细胞IL-17通路基因的DNA甲基化状态及基因表达,改变软骨细胞的炎症状态。[研究意义]膝骨关节炎病变软骨中IL-17信号通路关键基因呈低甲基化状态,上调了该通路蛋白的表达和活化,从而参与了关节软骨炎症的发生。这些结果有助于骨关节炎发病机制的阐明,DNA甲基化修饰有可能成为骨关节炎治疗的新靶标。