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为了研究病毒编码蛋白的结构与功能的关系,并为山东省PRRS及PCV的防治提供一种理论和实际依据,本研究对PRRSV SD1株的ORF5和PCV SD2株的ORF2进行了测序,根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCSA MCSB多克隆位点的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD2株的ORF2基因阅读框架,同时考虑外源基因的表达量在基因起始密码子的前面加入Kozak序列,分别设计了针对ORF5、ORF2的引物Y1/Y2,H1/H2。将PCR产物ORF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2,RT-PCR产物ORF5经双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建成重组质粒pIRES-ORF2/ORF5。经PCR、RT-PCR、双酶切及测序鉴定,证明成功构建了转移载体pIRES-ORF2/ORF5。
将构建成功的pIRES-ORF20RF5重组质粒用脂质体法转染真核细胞Marc-145,经G418加压筛选获得稳定表达的细胞株,以PCR、RT-PCR、和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明:经PCR、RT-PCR检测到两种目的基因的转录;间接免疫荧光试验检测到目的蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光,证明蛋白得到表达。
首次在国内将PRRSV ORF5与PCV2 ORF2同时插入哺乳动物细胞真核表达载体并进行成功表达,为构建PRRSV与PCV双基因真核表达载体的研究提供思路和依据。
从2006年6月份开始,我国南方暴发了严重的猪”高热病”,目前已造成上千万头猪只的死亡,给养猪业带来了巨大损失。山东省于2006年12月份开始暴发此病。通过细胞中传代培养,分离出2株变异毒株,通过RT-PCR技术从中扩增出PRRSV ORF5片段,并测其序列。应用DNASTAR、DNAMAN序列分析软件对所测的2株序列与北美洲原型(VR-2332株)、欧洲原型(LV株)和部分国内外分离株的相应片段进行核苷酸同源性比较,差异较大,均为强毒株。从而为山东地区无名高热PRRSV的控制及疫苗研究提供一些依据。
总之,本研究成功构建了能同时表达两种主要保护性抗原蛋白的真核表达载体,并在哺乳动物细胞Marc-145中成功表达。本研究为亚单位疫苗的研制奠定了理论和物质基础,将为PRRS及PC的防治带来新的技术手段。