凹叶厚朴再生体系构建及愈伤组织总酚含量变化研究

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凹叶厚朴(Magnolia officinalis subsp. biloba (Rehd.et Wils.) Law.)为木兰科木兰属植物,是我国分类学上原始的木本植物,同时也是我国传统中药材,药用根皮、枝皮及干皮,性温、味辛,具有温中下气等功效,用于消炎灭菌、胸腹胀满、痰饮喘满等症,在临床应用上占有非常重要位置。凹叶厚朴原产湖南、湖北、广西等地,分布广泛,集药、材、观赏于一体,是我国特有的经济树种,作为国家二级重点保护植物,利用前景十分广阔。本研究通过凹叶厚朴离体再生体系的构建,为优质种源的快速繁殖提供生产方法;通过不同外植体诱导愈伤组织并在不同条件下进行培养,检测其总酚含量的变化,为今后发展细胞培养提取总酚的生产提供参考依据。结论如下:1.人工去除外种皮前反复揉搓、温水浸泡、0.2%KMnO4初步消毒,无菌操作台上采用75%酒精消毒15s、0.1%HgCl2灭菌8min,污染率为22.6%,对种子伤害最小。2.凹叶厚朴再生体系构建:最佳种子初代诱导培养基为:3/4B5+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6.5g·L-1,PH5.8-6.0,温度24±1℃,光照时间12h·d-1,光照强度1500-20001ux;带叶片茎段为丛生芽增殖的最佳外植体,最佳增殖培养基为:MS+6-BA2.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1,丛生芽的诱导率达到93.18%,增殖系数达6.25;最佳生根培养基为:1/2MS+NAAl.0mg·L-1,蔗糖25g·L-1,生根率达81.5%。3.无菌苗的根、茎、叶等器官均能诱导愈伤组织,下胚轴作为外植体诱导效果最好,最佳诱导培养基:B5+6-BA2.0mg·L-1+2,4-D1.5mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6.5g·L-1,诱导率达90%以上;愈伤组织最佳增殖培养基为:B5+6-BA2.0mg·L-1+2.4-D1.5tng·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6.0g·L-1。4.凹叶厚朴愈伤组织总酚含量的变化:不同种源之间总酚含量差异较大,变化范围在0.01%-0.25%;同一种源的不同器官为外植体时,诱导的愈伤组织总酚含量差异显著,其中,幼茎诱导的总酚含量最高,下胚轴诱导的总酚含量最低;愈伤组织的褐化对总酚含量有影响,影响程度为:严重褐化>轻度褐化>无褐化;添加L-苯丙氨酸和DL-β-苯丙氨酸两种前体化合物培养都能有效提高愈伤组织的总酚含量,其中DL-β-苯丙氨酸的效果更好,可以提高总酚实际含量达0.06%-0.16%,比对照提高1.69%-7.27%。
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