胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)是一种具有强大的多向分化潜能及自我更新能力的多能干细胞，其来源于受精卵细胞分化后的早期囊胚内细胞团，在体内或体外可以分化为成体几乎所有类型的组织细胞，为研究胚胎发育、细胞定向诱导分化、组织器官工程、干细胞移植治疗等多个学科领域提供了理想的研究对象及细胞来源。应用ESC或其分化后细胞进行移植治疗成体器官的结构损伤及功能不全是近年来ESC研究及应用的主要进展之一，这一技术将可能成为未来临床上治疗某些不可逆性疾病的新选择。 小肠上皮组织主要由吸收细胞、杯状细胞、神经内分泌细胞及潘式细胞构成。这4种细胞均由位于肠隐窝底部的肠上皮干细胞(intestinalepithelialstemcell，IESC)分化而来，它们所组成的肠绒毛和隐窝结构是小肠施行吸收、分泌等生理功能的重要结构基础。正常情况下，IESC自身的增殖与分化维持一定的动态平衡。然而临床上某些疾病严重干扰了这种快速的自身修复机制，导致肠上皮形成难治性损伤，甚至累及至隐窝底部的IESC，使损伤不能修复，极大影响着患者的生活质量，是当今临床治疗上一个棘手的问题。 针对肠黏膜损伤的传统治疗方法，如：小肠移植治疗、全胃肠外营养及外源性补充细胞因子促进上皮再生等均存在一定的不足。近年来，一些学者开始探讨移植具有肠上皮修复潜能的细胞治疗难治性小肠损伤，其成果日益受到国内外学者的广泛关注。然而，IESC作为理想的小肠上皮修复细胞由于其来源受限，一直难以进行相关的实验研究。因此，寻求并建立一种新的用于移植修复小肠上皮损伤的IESC来源在推动细胞移植治疗肠道损伤方面具有重要意义。 本次研究利用小鼠ESC所具有的三个胚层分化潜能及表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)在肠上皮细胞和IESC分化中的重要作用，在体外使ESC形成胚体(embryonicbody，EB)，确定其中IESC和肠上皮细胞的前体细胞群一定型内胚层的分化时间点，并以此阶段的EB细胞作为前体采用EGF进行IESC的体外诱导分化，期望利用这一分阶段诱导方法确立体外诱导小鼠E14TG2a系ESC定向分化为IESC的条件，并评价其体内分化及修复放射性小肠损伤的能力，同时探索利用微球囊培养法、侧群细胞分选及构建IESC标志基因启动子报告基因载体等方法体外纯化IESC的可行性，为IESC体外诱导分化、分离及建立新的移植修复细胞来源提供实验基础。 研究目的： 本研究以小鼠ESC的多向分化潜能为基础，探讨体外分阶段诱导ESC分化为IESC的可行性及条件，为细胞移植治疗小肠上皮损伤及小肠组织器官工程提供细胞来源；在获得含有IESC的细胞群后，探讨通过侧群细胞分选、构建IESC标志基因启动子报告基因载体及微球囊培养法体外富集IESC的可行性，为体外纯化IESC积累实验经验。 研究内容及方法： 1.以小鼠E14TG2a系ESC作为研究对象，在体外进行扩增培养，采用1000u/ml的白血病抑制因子(leukaemiainhibitiryfactor，LIF)抑制其分化；并使用染色体G显带技术明确E14TG2a系ESC的染色体核型，为后续体内实验设计提供依据；采用悬滴培养法培养EB，使其进入三个胚层的分化阶段。 2.以CXCR4、E—cadherin(ECD)、Glypican1(Gpc1)、Transmembrane4superfamily2(Tm4sf2)、goosecoid(Gsc)作为定型内胚层的标志分子，采用流式细胞仪及逆转录聚合酶链反应(reverse—transcriptionpolymerasechainreaction，RT—PCR)监测EB形成过程中定型内胚层的分化情况，并与脏内胚层分化鉴别；同时探讨悬滴培养下含50ng/mlActivinA的无血清培养基在提高定型内胚层分化比例中的作用。 3.确定定型内胚层分化的时间点后，在体外采用含40ng/mlEGF的无血清培养基诱导推测的IESC(putativeIESC，PIESC)分化，并以Musashi1(Msi1)及hairyandenhancerofsplit1(Hes1)作为IESC的标志分子，采用实时定量PCR、Westernblots及免疫细胞化学监测及鉴定PIESC分化。 4.种植PIESC及对照细胞至NOD/SCID小鼠皮下，培育移植瘤，通过组织学和小肠上皮细胞标志分子的免疫组化及RT—PCR分析等方法观察PIESC在NOD/SCID小鼠体内的分化情况，并与对照组比较，评价其小肠上皮的分化能力。 5.利用16Gy的β射线一次性全腹部照射雌性BALB/c小鼠，制作急性放射性小肠损伤模型；通过设立照射及治疗(RT组)、照射不治疗(RNT组)、不照射但治疗(NRT组)及不照射不治疗(NRNT组)等组别评价照射后早期移植PIESC在修复小肠损伤和提高小肠修复质量中的作用，并利用性别交叉移植的方法，观察雄性PIESC来源的供体细胞在受体小肠、肝、肾中的定植情况。 6.PIESC及其对照分化细胞在Hoechst33342染色后进行侧群细胞的测定及分选，使用实时定量PCR及Westernblots测定IESC标志分子Msi1和Hes1在侧群及非侧群细胞中的表达，探讨侧群细胞分选在富集PIESC中的作用。 7.克隆猜测的Msi1启动子序列，并构建Msi1启动子报告基因载体pMsil—GFP，通过脂质体转染PIESC，分离GFP阳性细胞，利用实时定量PCR及Westernblots测定Msi1和Hes1在GFP+及GFP—组分中的表达，探讨构建pMsil—GFP在分离Msi1+Hes1+细胞(IESC)中的作用。 8.使用含40ng/mlEGF的DMEM/F12培养基悬浮培养PIESC，使其中部分细胞形成微球囊，利用离心法分离微球囊及其余的单个细胞，使用实时定量PCR测定两者中Msi1及Hes1的表达，评价利用这一方法富集Msi1+Hes1+细胞(IESC)的可行性。 实验结果： 1.小鼠E14TG2a系ESCs在添加1000u/mlLIF的基础上，可以在体外扩增，形成典型的ESC克隆。此株ESC的染色体核型正常，为(40，XY)，即雄性细胞。采用悬滴培养法，1×106/ml细胞密度的ESC可以形成1～1.5mm直径的EB，进入分化状态。 2.RT—PCR的分析结果显示，定型内胚层标志基因Gsc、Tm4sf2及Gpc1在5天EB中的表达相对辉度分别为0.9809±0.0083、0.9231±0.0097及0.8639±0.0075，显著高于其它阶段的EB(P<0.05)。流式细胞仪测定CXCR4+细胞、ECD+细胞及CXCR4+ECD+细胞在第5天EB中的比例分别为34.4±2.87％、29.0±3.21％及6.3±0.18％，显著高于其它阶段的EB(P<0.05)。采用含50ng/mlActivinA因子的无血清培养基可以使第5天EB中的CXCR4+细胞比例升高到41.9±3.21％，显著高于对照组(P<0.05)。 结论： 1.采用悬滴培养法，在去除LIF的培养基中ESC可以形成EB，进入分化状态。 2.悬滴培养5天的EB含有较多的定型内胚层细胞，是进行后续PIESC定向诱导分化的理想前体细胞群。 3.SF—ActivinA(50ng/ml)培养基可以使悬滴培养5天的EB中所含定型内胚层的比例进一步升高。 4.通过5天的SF—EGF(40ng/ml)诱导，5天EB细胞群可以在体外分化为高度同步表达Msi1及Hes1的PIESC，其中部分克隆中心部位的细胞同时表达Msi1及Hes1，具有IESC的特征。 5.无血清的SF—EGF培养基不能长期维持PIESC中Msi1及Hes1的高表达。 6.PIESC来源的移植瘤中大多为腺体样结构及未定形细胞，这些组织或细胞表达小肠各种上皮细胞的标志分子，证明PIESC具有高度特异的小肠上皮细胞体内分化能力。 7.全腹一次性照射16Gy的β射线可以引发小鼠的急性放射性肠炎。 8.PIESC移植入放射性小肠损伤小鼠体内以后，可以特异的定植于损伤的小肠上皮，并且直接参与小肠上皮的重建，改善上皮组织的修复质量，在损伤小肠的功能及结构恢复中发挥重要作用。 9.PIESC中存在侧群细胞，且更高表达Msi1及Hes1，利用流式细胞仪分选侧群细胞可以在一定程度上起到纯化Msi1+Hes1+细胞的作用。 10.小鼠Msi1基因起始密码子上游1208bp的序列中含有Msi1特异的启动子序列。 11.构建pMsi1-GFP质粒载体瞬时转染PIESC后可以利用GFP的表达标记Msi1+细胞，在此基础上利用流式细胞仪分选可以获得较为纯化的Msi1+Hes1+细胞。 12.PIESC在DMEM/F12培养基中具有形成微球囊的能力，但通过这一方法不能获得较为纯化的Msi1+Hes1+细胞。