研究背景与假设:动脉粥样硬化相关的心脑血管疾病是全球首位致死病因。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是众多心脑血管疾病共同的病理学基础,也是此类疾病防治的重要环节。然而,传统危险因素例如吸烟、高血脂、高血压、糖尿病等,仅能解释约50%的动脉粥样硬化的发病率,提示尚有未被认识或干预的非传统危险因素。动脉粥样硬化是血管壁受损后发生的一种慢性炎症过程并且炎症反应贯穿于斑块进展的各个阶段,提示慢性感染在动脉粥样硬化的发生发展中具有重要作用。大量的血清流行病学和临床观察研究发现,幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染与动脉粥样硬化及动脉粥样硬化性心脑血管病发生具有显著相关性。然而,尚无明确证据证实这种相关性是因果关系还是仅为促进作用。因此,本课题旨在探究H.pylori胃内感染是否直接诱发动脉粥样硬化的斑块形成或是否间接促进动脉粥样硬化斑块的进展。外泌体在介导细胞与细胞间和器官与器官间的信号交流和功能调节中具有非常重要的功能。大量的研究发现,感染性疾病中致病菌包括细菌、病毒和寄生虫等,可挟持外泌体分泌机器释放病原菌自身成分包括毒力因子和细菌表面抗原等,参与病原菌的自身存活、自我复制和改变宿主内环境等,从而激活宿主防御反应或发挥致病作用。最新的研究报道提示H.pylori感染宿主细胞来源的外泌体可递送至远隔器官可能在H.pylori感染所致的胃外疾病中具有重要作用。因此,本课题旨在探究H.pylori感染胃上皮细胞来源的外泌体是否进入循环参与动脉粥样硬化的发生发展。多项荟萃分析显示,CagA阳性的H.pylori感染与动脉粥样硬化及动脉粥样硬化性心脑血管病发生率相比CagA阴性的H.pylori感染具有更为显著的相关性。这些结果提示了CagA作为H.pylori关键毒力因子,可能与动脉粥样硬化发生发展存在可能相关性。最新一项研究发现H.pylori感染病人的血清外泌体内携带CagA蛋白,提示了CagA可能被外泌体递送至循环导致胃外疾病。然而,H.pylori感染胃上皮细胞释放的外泌体是否携带CagA蛋白尚不清楚。因此,本课题旨在探究H.pylori感染胃上皮细胞来源的外泌体携带H.pylori关键毒力因子CagA是否参与动脉粥样硬化的发生发展。研究目的:（1）研究H.pylori感染是否诱导动脉粥样硬化形成或促进动脉粥样硬化进展;（2）研究H.pylori感染胃上皮细胞来源的外泌体是否促进巨噬细胞源泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展;（3）研究H.pylori感染胃上皮细胞来源的外泌体蛋白CagA是否促进巨噬细胞源泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展。研究方法与结果:第一部分:（1）本研究首先使用C57BL/6野生型（WT）小鼠作为动物模型。将WT小鼠给予H.pylori PMSS1菌株灌胃造模4周并恢复两周后,分别给予正常饮食和高脂肪/高胆固醇饮食16周。H.pylori PMSS1菌株灌胃造模后,利用免疫荧光染色显示,H.pylori灌胃组小鼠胃粘膜组织内H.pylori定植率100%,PBS灌胃组小鼠H.pylori定植率为0。（2）主动脉血管组织大体油红O染色和主动脉根部HE染色显示,NCD饮食条件下,PBS组和H.pylori感染组WT小鼠在16周后均未观察到动脉粥样硬化斑块的形成。（3）主动脉血管组织大体油红O染色显示,HFCD饮食条件下,PBS组和H.pylori感染组WT小鼠在16周后均未观察到动脉粥样硬化斑块的形成。然而,主动脉根部横断面HE染色发现,H.pylori感染组WT小鼠主动脉附着缘出现了早期斑块形成,而PBS组WT小鼠均未出现斑块形成。（4）我们进一步使用载脂蛋白E敲除小鼠(ApoE^-/-)作为动物模型。将ApoE^-/-小鼠给予H.pylori PMSS1菌株灌胃造模4周并恢复两周后,给予高脂肪饮食8周或16周。主动脉血管组织大体油红O染色显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8周和16周后主动脉整体斑块面积和斑块占全内膜的面积百分比显著增加。主动脉根部横断面HE染色进一步提示,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8周和16周后主动脉根部斑块面积显著高于PBS组ApoE^-/-小鼠。（5）主动脉根部斑块油红O染色显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8周和16周后主动脉根部斑块油红O染色区域与斑块面积比显著增加。（6）免疫荧光组织化学染色显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8周和16周后主动脉根部斑块内巨噬细胞含量显著增加;与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠斑块内平滑肌细胞含量和I型胶原含量组间无统计学意义;但在H.pylori感染16周后,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠显著降低斑块内平滑肌细胞含量和I型胶原含量。组织化学分析还显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8周和16周后主动脉根部斑块有更大的坏死核心和更薄的纤维帽。（7）与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8和16周后体重以及血清的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白浓度组间差异无统计学意义。（8）免疫荧光组织化学染色显示,HFCD饮食条件下,PBS组WT小鼠16周后主动脉弓并无斑块形成,无巨噬细胞（CD68标记巨噬细胞）浸润和脂滴（Bodipy 493/503染料标记脂滴）的积累。H.pylori感染WT小鼠16周后再主动脉附着缘出现了早期斑块形成,斑块内主要是巨噬细胞浸润并且出现明显的脂滴蓄积。免疫荧光组织化学染色显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,H.pylori感染组ApoE^-/-小鼠8周和16周后主动脉根部斑块内显著增加巨噬细胞的脂滴蓄积和泡沫化形成。第二部分:（1）我们首先通过建立能够模拟体内的H.pylori感染胃上皮细胞体外模型,将H.pylori PMSS1与人胃上皮细胞系GES-1（MOI=1:50）共培养12 h后,去除共培养上清,无菌PBS溶液反复洗涤4次以去除细胞外及黏附在细胞表面的H.pylori;加入去除外泌体的完全培养基,并加入庆大霉素以阻止细胞外和黏附在细胞表面的H.pylori的生长;待孵育48 h后收集细胞上清,进一步采用标准的超速离心法提取对照组GES-1释放的外泌体（GES-EVs）和H.pylori感染GES-1后释放的外泌体（Hp-GES-EVs）。（2）我们采用PKH26标记Hp-GES-EVs,与巨噬细胞系Raw264.7细胞在37℃条件下共孵育6 h。通过激光共聚焦显微镜观察结果显示,大量外泌体被摄取并定位于巨噬细胞的胞浆内。（3）我们采用PBS+oxLDL（50μg/ml）、GES-EVs+oxLDL（50μg/ml）和Hp-GES-EVs+oxLDL（50μg/ml）分别刺激巨噬细胞24h,然后进行油红O染色检测三组细胞的泡沫细胞形成比例和细胞内脂质积累情况。结果表明:Hp-GES-EVs组巨噬细胞内脂滴积累及泡沫细胞形成比例较Control组（PBS处理）和GES-EVs组显著增多,而Control组（PBS处理）和GES-EVs组的细胞内脂滴积累及泡沫细胞形成比例组间无明显差异。（4）我们将上述分组的巨噬细胞通过胆固醇检测试剂盒分别检测总胆固醇及游离胆固醇,两者之差为胆固醇酯。结果表明,与对照组相比,GES-EVs不影响细胞内的总胆固醇和胆固醇酯的含量,而Hp-GES-EVs显著增加细胞内总胆固醇、胆固醇酯的含量。（5）我们选择16周高脂肪饮食喂养已形成较大斑块的ApoE^-/-小鼠作为动物模型。通过尾静脉分别注射200μL Dil标记的外泌体（0.1μg/μL）和对照组的Dil染料观察其体内分布。注射24 h后,置于小动物活体成像仪内,采用Ex/Em549 nm/565 nm进行荧光扫描,并拍摄X光片。结果显示,Hp-GES-EVs注射24h后,荧光强度蓄积在胸主动脉区域,而对照组无明显荧光强度蓄积。（6）我们迅速处死上述分组小鼠并采用PBS进行心脏灌流去除血液循环中的Dil标记的外泌体,取出主动脉和主动脉弓,避光条件下制备冰冻切片,置于共聚焦显微镜下观察主动脉和主动脉弓斑块内是否摄取荧光标记的外泌体（Dil-EVs）。结果显示,注射荧光标记的Hp-GES-EVs小鼠的主动脉弓斑块内分布较多的Dil-EVs,主要分布在巨噬细胞分布的脂质核心内,并可见细胞吞噬Dil-EVs（图）。（7）我们分别通过尾静脉注射PBS、GES-EVs和Hp-GES-EVs,每周注射两次,8周后处死动物。大体油红O染色显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,GES-EVs组ApoE^-/-小鼠主动脉整体斑块面积和斑块占全内膜的面积百分比无明显统计学意义,而Hp-GES-EVs组ApoE^-/-小鼠主动脉整体斑块面积和斑块占全内膜的面积百分比显著增加,动脉粥样硬化严重程度增加。主动脉根部横断面HE染色进一步提示,Hp-GES-EVs组ApoE^-/-小鼠的斑块面积显著高于GES-EVs组ApoE^-/-小鼠和PBS组ApoE^-/-小鼠。（8）我们通过油红O染色检测主动脉根部的粥样斑块。结果显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,GES-EVs组ApoE^-/-小鼠主动脉根部斑块油红O染色区域与斑块面积百分比无明显统计学意义,而Hp-GES-EVs组ApoE^-/-小鼠主动脉根部斑块油红O染色区域与斑块面积显著增加。（9）通过免疫荧光组织化学染色的方法标记巨噬细胞特异性标志物CD68和脂滴特异性染料Bodipy 493/503。结果显示,与PBS组ApoE^-/-小鼠相比,GES-EVs组ApoE^-/-小鼠主动脉根部斑块内巨噬细胞内脂滴含量无显著差异,而Hp-GES-EVs组ApoE^-/-小鼠主动脉根部斑块捏巨噬细胞内脂滴含量显著增加。第三部分:（1）我们通过免疫印迹检测H.pylori感染胃上皮细胞和所释放的外泌体内CagA的表达。结果显示,CagA表达在H.pylori感染的细胞和所释放的外泌体内,而不存在未感染的细胞和所释放的外泌体中。（2）我们采用PBS+oxLDL（50μg/ml）和rCagA（5μg/ml）+oxLDL（50μg/ml）分别刺激巨噬细胞24h,然后进行油红O染色检测两组细胞的泡沫细胞形成比例和细胞内脂质积累情况。结果表明:rCagA组巨噬细胞内脂滴积累及泡沫细胞形成比例较Vehicle组（PBS处理）显著增多。我们又进一步通过胆固醇检测试剂盒分别检测总胆固醇及胆固醇酯。结果表明,与对照组相比,rCagA显著增加细胞内总胆固醇、胆固醇酯的含量。（3）我们分别采用PBS和rCagA（5μg/ml）刺激巨噬细胞24 h后,添加荧光标记的Dil-oxLDL（20μg/ml）,直接观察巨噬细胞对脂蛋白的摄取。结果显示,两组细胞荧光强度无统计学差异,提示rCagA不增强巨噬细胞脂质摄取过程。进一步地,我们采用NBD标记的胆固醇（NBD-cholesterol）分别示踪检测由ApoA-I和HDL介导的胆固醇流出。结果显示,rCagA显著降低ApoA-I和HDL介导的胆固醇流出率。（4）我们通过免疫印迹和PCR检测介导摄取和流出的受体的蛋白和mRNA表达情况。与上述结果一致地是,免疫印迹结果显示,rCagA呈浓度依赖模式降低胆固醇流出受体ABCA1、ABCG1和SR-BI的表达,而不影响介导脂质摄取受体CD36、MSR1和LOX-1的表达。采用RT-PCR技术在mRNA水平检测ABCA1、ABCG1及SR-BI的表达,结果与蛋白表达相一致。结果显示,rCagA（5μg/ml）刺激巨噬细胞3h即可显著下调ABCA1、ABCG1和SR-BI的表达。（5）我们采用ApoE^-/-小鼠腹腔注射rCagA,一周三次,12周后处死动物。大体油红O染色显示,与Saline组ApoE^-/-小鼠相比,腹腔注射rCagA组ApoE^-/-小鼠主动脉整体斑块面积和斑块占全内膜的面积百分比显著增加,动脉粥样硬化严重程度增加。主动脉根部横断面HE染色进一步提示,rCagA组ApoE^-/-小鼠的主动脉弓斑块面积显著高于Saline组ApoE^-/-小鼠。（6）我们通过油红O染色检测主动脉根部的粥样斑块的脂质含量。结果显示,与Saline组ApoE^-/-小鼠相比,rCagA组ApoE^-/-小鼠主动脉根部斑块油红O染色区域与斑块面积显著增加。免疫荧光组织化学染色的方法标记巨噬细胞特异性标志物CD68和脂滴特异性染料Bodipy 493/503。与Saline组ApoE^-/-小鼠相比,rCagA组ApoE^-/-小鼠主动脉根部斑块内巨噬细胞内脂滴含量显著增加。（7）我们留取主动脉血管组织匀浆裂解,免疫印迹结果显示,与Saline组ApoE^-/-小鼠相比,rCagA组ApoE^-/-小鼠主动脉血管组织内ABCA1、ABCG1和SR-BI的蛋白表达下调。进一步地,采用RT-PCR技术在mRNA水平检测ABCA1、ABCG1及SR-BI的表达,结果与蛋白表达相一致。（8）免疫荧光组织化学染色显示,与Saline组ApoE^-/-小鼠相比,rCagA组ApoE^-/-小鼠主动脉斑块有更大的坏死核心和更薄的纤维帽。（9）免疫印迹结果显示,rCagA刺激巨噬细胞可显著下调PPARγ和LXRα的蛋白表达。研究结论:通过本研究我们得到以下结论:（1）H.pylori感染主要依赖于加剧巨噬细胞源泡沫细胞形成从而促进动脉粥样硬化的斑块进展和不稳定性;（2）H.pylori感染胃上皮细胞来源的外泌体蛋白CagA介导H.pylori感染的促动脉粥样硬化作用;（3）机制方面,CagA通过下调转录因子PPARγ/LXRα,并由此抑制胆固醇流出受体ABCA1/ABCG1/SR-BI的表达,阻断巨噬细胞胆固醇流出,从而加重巨噬细胞泡沫化;这一研究进一步揭示了CagA阳性幽门螺杆菌感染胃上皮细胞来源的外泌体蛋白CagA在巨噬细胞泡沫化中的作用及机制,为解释H.pylori感染与动脉粥样硬化及相关心脑血管事件发生提供了可能机制,为预防和减少H.pylori感染相关的心脑血管事件的发生提供了新的证据。