天然免疫是机体识别病原微生物，抵御病原体感染的第一道防线。甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）是天然免疫系统中的关键分子，为肝细胞分泌的血浆蛋白，属C型凝集素超家族中胶凝素（collectins）家族成员。MBL籍其模式识别作用选择性识别多种病原体的糖结构，然后通过激活补体凝集素途径而发挥溶破和间接调理功能，并能与吞噬细胞胶凝素受体（即C1qR）结合而启动调理吞噬，还可介导MBL依赖的细胞介导的细胞毒作用。而且，MBL也是一个重要的粘膜表面防御分子。成熟MBL肽链自N端至C端依次有4个结构域：富含Cys的N端区、胶原样区（collagen-like region，CLR）、颈区和C端糖识别域（carbohydrate-recognition domain，CRD）。完整MBL分子是同质三肽链结构单位的寡聚体，多至六聚体。只有高寡聚体MBL分子才具有生物学活性。CRD是MBL分子的识别功能区，能选择性识别多种病原体的糖结构；而CLR是其效应功能区，MBL激活补体和结合胶凝素受体的功能定位于此区。MBL分子通过其CLR与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBL associated serine proteases，MASP1、MASP2）结合形成复合物，在其CRD识别、结合病原微生物的糖结构后，可活化MASPs酶原，从而激活补体凝集素途径而发挥天然抗感染免疫效应。MASPs肽链由6个功能区组成，从N端至C端依次为CUB区（complement subcomponent C1r／C1s-like domain）、EGF区（epidermal growth factor-likedomain）、CUB区、补体调控蛋白（complement control proteins，CCP）区、CCP区和丝氨酸蛋白酶（serine proteases，SP）区。初步研究表明，N端的3个结构域即2个CUB区和1个EGF区是MASPs与MBL-CLR结合的区域，能以Ca²⁺依赖方式与MBL-CLR相互作用。然而，这种相互作用的详细情况、特别是MBL-CLR中MASPs结合位点尚不明了。已在MBL基因编码CLR的第一外显子发现3个点突变CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，而人群中这些点突变的基因频率极高，可引起血清MBL水平低下及活性降低从而导致调理吞噬作用缺损。MBL缺损主要表现为各种病原体的反复急慢性感染，甚至HBV、HIV等特殊病原体的感染及其发展转归也与MBL缺损有关。MBL基因突变还与自身免疫病如（SLE、RA、IgA肾炎及皮肌炎等）密切相关。然而，MBL基因突变引起免疫缺损的发病机理迄今未明。本实验研究首先采用原核表达系统分别表达了MBL-CLR和MASPs蛋白，利用哺乳细胞表达了突变MBL蛋白，然后建立MBL与MASPs结合的体系，合成一系列CLR短肽来阻断这种结合，并探索突变MBL蛋白与MASPs的相互作用，以阐述MBL分子CLR精细的结构-功能关系。其意义在于：从一个方面揭示MBL介导天然免疫防御的机理；有助于阐明MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机制。一、人MBL-CLR蛋白的原核表达及鉴定使用Primer premier5.0软件，设计并合成引物，以含有汉族人野生型MBL全长编码区cDNA的质粒pGEM-MBL为模板，PCR扩增出长度约180bp的人MBL-CLR基因片段，将其克隆至pET32a原核表达载体中，构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段，经测序鉴定序列正确后，导入大肠杆菌BL21（DE3）中，以IPTG诱导重组pET32a-MBL-CLR质粒表达Trx-CLR融合蛋白。对以可溶性表达的Trx-CLR融合蛋白经Ni+-NTA agarose层析柱纯化，获得了纯化的融合蛋白。纯化蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带，Western blot分析表明，3条蛋白带均可与抗His抗体起反应，3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA证实，纯化蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。二、MASP1、MASP2 N端和C端蛋白的原核表达及鉴定使用Primer premier5.0软件设计并合成引物，分别以含人MASP1、MASP2全长编码区cDNA的pGEM-MASP1、pGEM-MASP2质粒为模板，分别扩增出长度约860bp和840bp的人MASP1和MAS2的N端区基因片段，分别将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中，经双酶切和测序鉴定序列正确后，导入大肠杆菌，以IPTG分别诱导重组pGEX-4T-MASP1-N和pGEX-4T-MASP2-N质粒表达GST-MASP1-N、GST-MASP2-N融合蛋白。对以包涵体形式存在的GST-MASP1-N和GST-MASP2-N融合蛋白经8mol／L尿素变性、梯度复性，获得结构折叠正确的重组蛋白，经GSTrap层析柱纯化后，获得了纯化的融合蛋白。经ELISA和SDS-PAGE鉴定，证实为GST-MASP1-N、GST-MASP2-N融合蛋白。同样构建了pET17b-MASP1-C和pET17b-MASP2-C原核表达载体，诱导表达了MASP1-C和MASP2-C蛋白，对以包涵体形式表达的蛋白进行变性复性后经Ni⁺-NTA agarose层析柱纯化，获得了纯化的MASP1-C和MASP2-C融合蛋白。三、定位MBL-CLR的MASPs结合位点建立MASPs与野生型MBL蛋白和MBL-CLR蛋白结合的反应体系，设计合成一系列CLR短肽对MBL与MASPs的结合进行抑制或阻断实验。从MBL-CLR蛋白阻断野生型MBL与MASPs结合反应的结果来看，MBL-CLR可有效地抑制MASP1-N、MASP2-N蛋白与野生型MBL的结合，其50％抑制浓度分别为0.3g／L和0.15g／L；MBL-CLR也能很好地与MASP1-N和MASP2-N蛋白结合，进一步证明MASPs确实是与MBL-CLR结合。MBL-CLR区由59个氨基酸残基组成，由19个规律的Gly-X-Y胶原三联体重复顺序构成，其中有一处Gly-Gln断裂。根据CLR的序列及特点先后设计了9条肽进行合成。其中1～4号肽每个肽约22个氨基酸残基，覆盖了CLR全长59个氨基酸，并有部分序列重叠；5～8号肽主要针对点突变位点设计，5号肽为野生型，6、7、8号肽分别是含32Cys、34Asp、37Glu残基的肽。对于MASP1-N、MASP2-N蛋白与重组MBL野生型MBL蛋白、MBL-CLR蛋白的结合，3号和5号肽有一定抑制作用，抑制率在25％-45％之间，2号肽有较好抑制活性，抑制率可达50％以上，而1、4、6、7、8号肽抑制作用不明显。根据这些结果，以2号肽序列为主，考虑其与3号和5号肽的重叠部分，重新设计合成了9号肽，并将序列中2个脯氨酸残基（P）改为羟基脯氨酸（O）：GLRGLQGPOGKLGPOG。抑制实验发现，9号肽能有效抑制MASP1-N、MASP2-N蛋白与重组野生型MBL蛋白、MBL-CLR蛋白结合，抑制率达70％以上。9号肽序列位于MBL-CLR中45～60位氨基酸残基，正巧是Gly-Gln断裂之后的16个残基。从哺乳动物CLR的序列来看，9号肽氨基酸序列是相对保守的，可能各种属动物的MBL均通过这一区域结合MASPs。当然，这一结论尚需进一步验证。此外，9号肽与MASPs结合的亲和力仍然偏低，尚需在今后的研究中进一步提高短肽的亲和力。同样也利用MBL-CLR能与U937细胞胶凝素受体的作用建立了细胞ELISA的体系，从MBL-CLR与U937细胞的结合试验来看，CLR确实具有胶凝素类似的作用能够和U937细胞上的胶凝素受体结合。但从合成肽抑制试验来看，没有肽段起到有效的抑制作用，这表明CLR与U937细胞的胶凝素的结合位点并不同于MASPs的结合位点，而真正的结合位点仍需进一步研究。四、突变型MBL蛋白与MASPs的结合作用MASP1-N和MASP2-N蛋白不仅能与重组野生型MBL蛋白结合也能与32Cys、34Asp、37Glu突变型MBL蛋白结合，然而，在同样的包被浓度下，与野生型MBL蛋白的结合力高于其它3种突变蛋白。在同等条件下，32Cys突变型蛋白与MASP1-N、MASP2-N蛋白的结合力最低，与34Asp突变型蛋白的结合力次之，与37Glu突变蛋白的结合力相对较高。此外，9号合成肽可以抑制MASP1-N和MASP2-N蛋白与3种突变型MBL蛋白结合。结果表明，MBL-CLR的这3个点突变与MBL的MASPs结合位点不重叠，虽然对MBL与MASPs的结合有一定影响，但推测是MBL点突变导致MBL寡聚化程度降低而影响其MASPs结合亲和力，而非突变产物的直接效应。