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猪卵母细胞的冷冻和体外成熟技术已经成为现代养猪业与生物医学领域中的一项重要技术。然而目前这些技术存在较多的问题,特别是猪卵母细胞的冷冻一直没有得到有效的解决。为进一步提高猪卵母细胞的冷冻效果和体外成熟率,本试验研究了渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、冷冻解冻步骤、不同处理方法对猪未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响,并从成熟液体积、生长因子、卵泡液和条件化培养体系等方面对猪未成熟卵母体外成熟进行了研究,获得如下结果。1.乙二醇(EG)组卵母细胞所取得的成熟率最高达到12.9%,显著好于丙二醇(PROH, 3.7%)、甘油(GLY, 1.9%)和对照组(0.0%, P<0.05),但与二甲基亚砜(DMSO)组(8.6%)比较差异不显著(P >0.05);采用两两组合后, EG+DMSO组获得的成熟率最高(9.6%),显著优于PROH+GLY组(0.0%)和对照组(0.0%,P<0.05),但与其它组相比较差异不显著。2.在添加葡萄糖组,使用1.5M冻后获得最高成熟率(8.7%),但与使用其它浓度的葡萄糖组比较无显著差异。在蔗糖组,添加0.75M冻后获得最高成熟率(19.9%),显著高于0.25M组(8.1%, P<0.05),但与1.0M(16.9%)和0.5M(18.6%)组相比较差异不显著(P>0.05);当添加3.0 g/ml聚蔗糖时冻后成熟率最高(13.4%),但和其他各浓度聚蔗糖组比较无显著差异(P>0.05)。在枸杞多糖组,添加0.10 g/ml组冻后成熟率达21.9%,显著高于0.05 g/ml(10.5%)和0.025 g/ml(6.9%, P<0.05),但是与添加0.075 g/ml组比较差异不显著(18.7%, P>0.05)。3.六步法(12.3%)和三步法(11.1%)所取得的冻后成熟率显著高于一步法(1.3%, P<0.05),六步法稍优于三步法,差异不显著;四步解冻法(12.7%)和三步解冻法(10.5%)所取得的冻后成熟率显著高于一步法(6.7%, P<0.05),但与二步法相比较差异不显著(7.3%, P>0.05)。卵母细胞在用CB处理的情况下较长时间暴露于冷冻液的冻后成熟率(17.3%)要显著高于短时间暴露组(4.8%, P<0.05),而无CB处理时,结果相反,较长时间暴露于冷冻液组的冻后成熟率(6.9%)显著低于短时间暴露组(16.4%, P<0.05).4.培养猪卵母细胞时,使用500μl(73.6%)、750μl(73.3%)和1000μl(69.1%)成熟液卵母细胞成熟率要显著好于微滴培养(52.4%, P<0.05),但与使用250μl成熟液培养无显著差异(66.0%, P>0.05)5.使用10ng/mlEGF获得的成熟率(75.7%)要显著高于使用10ng/ml FGF(60.5%)和空白对照组(57.9%, P<0.05),但与使用10ng/ml IGF-I组取得的成熟率无显著差异(68.0%, P>0.05)。6.使用卵泡期、排卵期和黄体期卵泡液组取得的成熟率(69.8%, 65.5%, 68.4%)与对照组(67.0%)相比较无显著差异(P>0.05),但使用白体期卵泡液组取得的成熟率(54.4%)显著低于对照组(P<0.05)。7.猪卵母细胞与几种体细胞共培养,颗粒细胞对卵母细胞体外成熟有显著的促进作用(75.8%),明显优于对照组(66.7%, P<0.05)。输卵管上皮细胞和胰岛细胞对成熟也有促进作用,但与对照组比较差异不显著(P>0.05)。