研究背景：Small interfering RNA (siRNA)是一种长度为21-25核苷酸的小RNA分子，由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成，其是siRISC的主要成员，可激发与之互补的目标mRNA的沉默。本课题前期的研究显示：免疫组织化学方法检测到半乳糖凝集素-3（galectin-3）蛋白在II期大肠癌的实体瘤标本中呈现一种高表达的趋势，与癌旁组织相比，具有显著性差异；且在随后的大肠癌细胞实验中发现，低分子柑橘果胶（Low molecular weight citruspectin,LCP）+奥沙利铂联合组较奥沙利铂单药组可增加大肠癌细胞HCT-116、HT29的细胞凋亡，联合组和单药组差异具有显著意义；此外，在小鼠结肠癌肝转移模型的研究中还发现：ELISA方法检测显示Galectin-3在结肠癌肝转移中呈高水平表达，与阴性对照组相比，差异具有显著意义（P<0.05）,且LCP能明显抑制结肠癌肝转移的发生。本次实验旨在通过对大肠癌细胞株中的galectin-3蛋白进行干扰来进一步地证实galectin-3蛋白在大肠癌治疗中的作用同时也为大肠癌的靶向治疗提供一定的积极的理论基础。方法：1.五种大肠癌细胞株HCT116、HT29、SW116、SW480和SW620的培养：1.1用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液，在37摄氏度、5%CO2的培养箱中分别培养五种大肠癌细胞株HCT116、HT29、SW116、SW480和SW620，每2-3天换液一次，待该贴壁细胞生长至80%密度时进行传代，传代2-3次后选择状态较好的对数生长期细胞进行试验；1.2将上述对数期生长状态较好的大肠癌细胞株进行离心收集，然后向其中加入细胞冻存液40%RPMI1640、50%胎牛血清以及10%二甲基亚砜（DMSO）总体积为1.5毫升，反复轻轻吹打培养液数次，重悬细胞，冻存保种的细胞浓度最好控制在5X106个/毫升左右的水平以确保最佳的冻存效果，再分别进行4摄氏度以及液氮罐保种备用。2.western bloting法筛选出galectin-3蛋白含量最高的细胞株：选择上述对数期生长状态较好的五种大肠癌细胞株：HCT116、HT29、SW116、SW480和SW620细胞，采用WB方法依次进行蛋白样品的收集、3.siRNA封闭galectin-3的表达：3.1针对galectin-3基因进行shRNA靶点序列的设计并进行合成；3.2将siRNA序列克隆至慢病毒干扰载体中并确保测序的正确；3.3将已制备好并测序正确的galectin-3慢病毒干扰载体以及其他的包装用质粒共同转染到慢病毒包装细胞系中，制备慢病毒；3.4将上述制备好的慢病毒进行感染靶细胞，感染一段时间后再用WB方法对galectin-3蛋白表达抑制效果的鉴定。4.用western bloting方法检测siRNA封闭galectin-3蛋白表达的效果：收集上述经过感染处理后的靶细胞，然后用WB方法对其进行干扰效果的测定，并同时用抗生素筛选出抑制效果较好的稳定细胞株，收集该稳定细胞株并进行4摄氏度以及液氮罐保种以备后续实验所需。5.流式细胞术检测细胞凋亡的变化:5.1细胞培养：5.2分别向A组（未经siRNA封闭galectin-3表达的细胞株）和B组（经siRNA封闭galectin-3表达的细胞株)加入IC50终浓度的奥沙利铂进行处理并在培养瓶上做好标记以便于识别；1.奥沙利铂实验浓度的选择：据本实验前期CCK-8法测定的结果显示大肠癌细胞株的奥沙利铂IC50值结果如下所示：大肠癌细胞株IC50值HCT116细胞34.00微摩尔/升HT29细胞14.73微摩尔/升SW116细胞27.68摩尔/升SW480细胞22.26摩尔/升从上述数据可见，奥沙利铂的培养液终浓度应该选择galectin-3蛋白表达量最高的SW116的奥沙利铂IC50值27.68摩尔/升；5.3分别孵育A、B两组细胞至6小时、24小时、以及48h用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（货号为KGA106）对其进行细胞凋亡的检测：PBS洗2次；重悬细胞，使其浓度为1×106/mL。加100μL细胞悬液(约为1×105)于5mL流式管中，每管加入5μL Annexin V/FITC和5μL20μg/mL的碘化丙啶(PI)，避光标记15min。对照不加Annexin V作校正因子。反应管中加入400μL PBS；5.4用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况并对实验图片以及实验数据进行统计学分析；6.统计学方法：IC50值均采用CompuSyn软件计算；各组间的比较均采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析或者t检验；检验的水准均采用а=0.05。结果：1.通过western bloting法对五种大肠癌细胞株HCT116、HT29、SW116、SW480和SW620中galectin-3蛋白进行检测，并利用Brandscan5.0软件对WB结果进行灰度分析显示galectin-3表达从高至低依次为：1.SW116细胞56.2%；2.HCT-116细胞49.3%；3.HT-29细胞46.2%；4.SW620细胞43.6%；5.SW480细胞46.2%；2.分别利用针对galectin-3序列5’-GAGAGTCATTGTTTGCAATA和5’-GCTCACTTGTTGCAGTACA的特异性shRNA，经慢病毒载体pLVTHM对结肠癌SW116细胞galectin-3蛋白的表达进行干扰，用western bloting法测得其干扰效率分别为54.3%和61.9%。3.通过流式细胞仪对干扰galectin-3蛋白后SW116+奥沙利铂的细胞凋亡率进行检测，并用SPSS13.0软件对其结果进行分析显示，与SW116细胞相比，差异具有显著意义（P<0.05）。结论：1.五种大肠癌细胞株HCT116、HT29、SW116、SW480和SW620中均有galectin-3蛋白表达，表达最高者为SW116；2.慢病毒载体pLVTHM可成功干扰结肠癌SW116细胞galectin-3蛋白的表达，干扰效率分别为54.3%和61.9%；3.奥沙利铂可增加干扰galectin-3蛋白后SW116的细胞凋亡率，与SW116细胞相比，差异具有显著意义（P<0.05）。