背景:　　 癫痫是神经系统常见疾病之一，是脑部神经元的异常同步放电所致的慢性神经系统损害。颞叶癫痫是最常见的癫痫发作类型，且大多数为难治性癫痫。热休克蛋白(iSPs)是一类具有细胞保护作用的分子伴侣[14],，根据其功能不同可分为组成性表达的热休克蛋白(HSC)及诱导性表达的热休克蛋白(HSP)，正常情况下，HSC在蛋白质合成过程中起分子伴侣的作用，而HSP仅在应激情况下出现，是一种应激蛋白。发生应激情况时，HSP的表达暂时性增多，通过提升识别暴露于变性蛋白表面的疏水性区域帮助蛋白重新折叠、加速不可逆变性蛋白质的清除及降解，发挥细胞保护作用。关于小分子热休克蛋白(sHsps)的新近研究发现HSPs在疾病发生过程中可能具有细胞保护作用。近年来，HSPs在中枢神经系统对神经细胞的保护、修复功能等方面引起了广泛关注。热休克蛋白不仅可由高温诱导生成，也可由痫性发作、缺血缺氧、氧化应激、感染等刺激产生。已有研究证实癫痫发生后大脑可通过激活具有神经保护作用的信号通路，诱导HSP暂时性表达增加，一方面对抗肽链未折叠状态或阻止其错误折叠，指导蛋白质的正确合成，另一方面抑制凋亡级联反应，并促进细胞从应激状态中恢复，以保护神经细胞免遭不可逆性损害。热休克蛋白22(Hsp22，又称HspB8、H11、E2IG1)是近期发现的一种小分子热休克蛋白，该蛋白含有典型的α-晶状蛋白结构域，通过该结构域能与其它不同分子量的热休克蛋白发生相互作用。目前已有体外实验报道Hsp22同样具有分子伴侣活性，并且它可在体内阻止多聚谷氨酰胺蛋白的聚集。　　 凋亡是细胞主动发生的由基因调控的程序性死亡，涉及凋亡信号通路的激活。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是一组非活性的胞内半胱氨酸蛋白酶，凋亡过程中由蛋白水解酶激活，形成激活态的半胱氨酸蛋白酶并持续表达于凋亡细胞内。目前研究证实了14种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的存在，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3，CPP32)是其中一种。CPP32以酶原形式存在于包括神经元在内的活细胞中，在神经元凋亡中起主要作用。CPP32在一系列神经变性疾病中起到决定性作用。　　 已有文献报道在人海藻酸致痫模型、匹罗卡品致痫模型和局部电刺激癫痫模型中Hsp70和Hsp27表达上调，人海藻酸致痫模型研究中，随着人海藻酸剂量增大，Hsp70表达逐渐上升，二者呈剂量依赖关系，并且已有研究证实在癫痫模型中Hsp70和Hsp27均可能通过抑制凋亡通路发挥神经保护作用。而对于癫痫模型中Hsp22是否对致痫后神经细胞具有保护作用目前尚未见文献报道。　　 目的：　　 检测匹罗卡品致痫小鼠模型中Hsp22和caspase-3的动态变化，探索Hsp22在癫痫发生过程中对神经细胞的保护作用。　　 方法　　 癫痫组及对照组小鼠分别于造模成功后1，3和7天处死，通过Nissl染色观察海马神经元的数量在痫性发作前后的变化;行免疫组织化学染色观察小鼠海马结构的病理形态改变，并观察海马神经元中Hsp及caspase-3的表达情况;通过western blot观察海马Hsp22和和caspase-3蛋白表达的动态变化。　　 1.实验动物　　 本实验于2011-2012年在中南大学湘雅医院神经内科实验室进行。依照中国动物福利保护条例对实验动物予以必要的预防处理，并将实验动物数量及实验动物所受痛苦减至最小。所有的实验过程及动物处理均遵循当地权威部门认可的实验守则。动物饲养于单独的透明树脂玻璃箱中（5只/箱），按12-h白一昼周期变化，环境温度控制于24±1℃，予以食物及水，自由取食。　　 2.实验分组　　 本实验选取八十只体重在22-27g之间的C57BL/6小鼠，分为对照组及实验组。对照组的30只小鼠予生理盐水注射，实验组的50只小鼠予匹罗卡品注射。根据Racine判定标准，选取予匹罗卡品注射后癫痫发作在4级和5级，并持续30分钟的小鼠纳入癫痫组。匹罗卡品反复注射后，实验组有6只未达到癫痫持续状态(SE)的小鼠(12％)被剔除。分别有9、13、17、5只小鼠在注射第1、2、3、4次匹罗卡品后约14-160分钟出现SE症状。44只出现SE症状的小鼠中，有14只(28％)最终死亡。剩下的30只(60％)存活小鼠被随机分为3组（每组10只），分别于SE症状出现后第1、3、7天处死。　　 3.SE模型　　 先对小鼠予匹罗卡品(330mg/kg)腹腔注射以诱导全身型SE，而后每30分钟以165mg/kg的剂量重复注射，直至SE出现。在注射匹罗卡品前30分钟，对小鼠予东莨菪碱(1mg/kg)皮下注射以对抗匹罗卡品的外周胆碱能样作用。所有的小鼠在应用匹罗卡品后都出现了全身型SE的征兆。按照Racine分级（1级:动作中止、凝视;2级:点头运动、牙关紧闭;3级:单侧前肢痉挛;4级:双侧前肢痉挛;5级:严重发作、丧失自主体位;6级:死亡）评定小鼠痫性发作严重程度。在SE出现1小时后予地西泮(4mg/kg)腹腔注射以终止发作。小鼠在1小时的SE发作期中约有30分钟处于第3级的状态。在SE诱导后的前4小时对小鼠进行监视。予对照组小鼠（30只）以生理盐水代替匹罗卡品予同样处理，未出现SE症状，予地西泮首次注射后，迅速以1ml生理盐水腹腔注射，并在第二天早、晚各重复腹腔注射1ml生理盐水一次。在本研究中，约有60％注射匹罗卡品的小鼠出现全身型发作并存活。对小鼠行为进行评定者对实验处理并不知情。　　 4.免疫组织化学　　 在匹罗卡品诱导出现癫痫持续状态后的第1、3、7天处死动物，予以10％的水合氯醛(5mg/kg，i.p)麻醉，经心脏灌注50ml0.9％Nacl，然后缓慢、匀速灌注30ml含4％多聚甲醛(PFA)的0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)。灌注完毕迅速取脑，将脑组织浸泡于4℃多聚甲醛14小时，再依次于20％和30％的蔗糖溶液中分别浸泡48小时。实验组动物与配对的对照组动物同时处死。用恒冷切片机将脑组织以冠状位连续切片至16μm厚度，再于0.1M PBS中复温，贴片于载玻片上，风干3天，保存于-70℃冰箱备用。行免疫组织化学染色前将玻片置于室温下风干30分钟，以0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。将载玻片浸泡于3％的双氧水溶液内30分钟以消除内源性过氧化物酶，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟;浸泡于柠檬酸溶液中，于微波炉内加热2次，每次8分钟，再置于室温下冷却1小时，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。将切片分为1-Hsp22组和2-Capp32组。以10％正常山羊血清+2％BSA、5％BSA在37℃分别对Hsp22、Capp32的非特异性结合位点封闭2小时。滴加一抗(以2％BSA稀释成1∶10000抗Hsp22抗体(ab79784)、1∶200抗casepase-3（L-18）抗体（sc-1225）），4℃孵育过夜。次日取出切片，以0.01M PBS洗涤5次，每次5分钟。滴加二抗(Hsp22用抗兔IgG，Capp32用抗山羊IgG)，37℃孵育1.5小时。PBS洗涤6次，滴加DAB显色液以观察抗Hsp-22抗体及抗-Cpp32抗体的结合情况。流水冲洗数分钟以终止显色反应。以50％、70％、90％、95％乙醇梯度脱水、二甲苯透明、封片备用。切片用于Nissl染色及Hsp22免疫组化，以便比较同一小鼠中海马结构神经变性与Hsp22的表达水平之间的关系。类似于予以对照组动物生理盐水，予以免疫组化过程中的对照切片（来自于2个出现SE症状的小鼠）除一抗之外的所有上述处理步骤，免疫组化中的对照切片未出现免疫染色现象。　　 5.图像分析　　 Hsp22及Capp32阳性神经元数量的定量分析，由两名对分组设计不知情的观察者完成。随机挑选5个不同视野，对照组选取特定部位，20x物镜下在同一视野框内计数细胞数。在CA1区，随机选取五个不重叠视野，计数每个视野的阳性神经细胞数，但当神经细胞位于边缘时可以重叠。在CA3区，随机选取五个不重叠视野，计数每个视野的阳性细胞数。　　 将每个视野中Hsp22及Capp32阳性神经细胞数的平均值制做成表格以便统计分析。以均数±标准差分析实验组及对照组小鼠的阳性神经元数目。实验数据采用SPSS17.0统计软件进行混合模型的方差分析(ANOVA)，检验在不同组（实验组与对照组）及不同时间点（第1天、第3天、第7天）的每个视野中阳性神经元数目的差异显著性。认为P＜0.05时，差异具有显著性。　　 6.Western Blot　　 10％水合氯醛腹腔注射以麻醉小鼠，待其失去知觉后，用剪刀断头，剪开颅骨，快速取整个脑组织于冰床上，沿矢状缝分离海马周围的大脑皮质及中脑，取出完整的海马组织。取海马组织，按每1Omg组织加100μL蛋白裂解液于研钵内混匀，加液氮充分研磨至匀浆。转移至EP管内，2000rpm下4℃离心10分钟，收集上清液即样本蛋白。采用Bio-Rad蛋白定量试剂盒测定海马组织的蛋白浓度。将蛋白分装后保存于-70℃备用。　　 从每组中随机选取不同个体的蛋白样本行Western Blot检测。每份海马组织样品（含30μg蛋白）按蛋白:缓冲液=4∶1比例加入上样缓冲液，并以裂解液调整至等体积后，100℃变性10分钟，上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中行电泳。蛋白电泳后以PVDF膜在转膜缓冲液（甘氨酸2.9g，Tris5.8g，200ml甲醇，用双蒸水定容至1L，现配现用，4℃预冷）中70V恒压转膜2小时。转膜完成后，将膜置于丽春红染液中染色5分钟，以蒸馏水轻漂数次除去浮色，估测上样量是否合适及转膜是否成功。TBST缓冲液漂洗除去丽春红染料后，以含5％ BSA的TBST封闭1小时。加入一抗后置于4℃冰箱内孵育12小时以上（Hsp22及Casepase-3的一抗以含2％ BSA的TBST缓冲液按1∶1000稀释）。将孵育完一抗的膜置入TBST缓冲液中漂洗数次。用含2％ BSA的TBST配制抗兔IgG及抗山羊IgG作为二抗，室温下孵育2小时。以β-actin作为内参，采用ECL发光试剂检测反应强度。以胶片压片曝光后，显影、定影、晾干。图像扫描后以Quantity One软件扫描条带灰度行定量分析。在5只不同小鼠进行5次独立重复试验，取最具代表性的结果附图。　　 结果:　　 利用免疫组织化学和蛋白印迹方法研究匹罗卡品致痫小鼠模型海马神经元Hsp22动态表达变化。根据Racine判定标准，选取予匹罗卡品注射后癫痫发作在4级和5级，并持续30分钟的小鼠纳入模型组，SE小鼠表现为对外界刺激无应答和无意识状态。实验组中有60％(n=30)小鼠致痫成功，28％(n=14)小鼠死亡，12％(n=6)未进入癫痫持续状态，未纳入癫痫组。Nissel染色显示与对照组比较，癫痫组小鼠海马神经元缺失明显，两组之间有明显统计学差异(P＜0.05)，而癫痫组小鼠海马神经元缺失以CA1区和CA3区较为明显。免疫组织化学染色显示对照组与癫痫组小鼠海马结构中均可见Hsp22阳性表达细胞，且多分布于CA3和CA1区，癫痫组Hsp22阳性表达细胞主要分布于CA1区，而对照组Hsp22阳性表达细胞主要分布于CA3区。当然，与对照组比较，癫痫1天、3天和7天组小鼠海马区Hsp22阳性表达细胞数均增多，而癫痫3天组小鼠海马区Hsp22阳性表达细胞数达到高峰，随后的癫痫7天组中Hsp22阳性表达细胞数略有下降，两组相比有明显的统计学差异(P＜0.05)。　　 蛋白免疫印迹分析显示对照组Hsp22无明显表达，而在癫痫1天、3天和7天组该蛋白显著表达，与对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05)，与免疫组织化学染色定量分析结果一直，Hsp22第3天有一过性表达高峰，随后第7天表达量略有下降。对照组中caspase-3无明显表达，癫痫组1天、3天和7天组表达明显增多，癫痫组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其中癫痫1天组表达最多，3天和7天组中caspase-3表达量逐渐下降。　　 1.Hsp22表达　　 免疫组织化学结果显示对照组小鼠海马区仅有少数Hsp22阳性表达细胞，而在不同时间点的癫痫组小鼠海马区中Hsp22阳性细胞均明显增多;Hsp22阳性表达细胞数在第1天癫痫组中迅速增多，第3天达到顶峰，然后相对性减少直至第7天。癫痫组小鼠海马的不同区域的Hsp22阳性表达细胞数均增加，但以CA3区和CA1区增加更为明显，而CA3区增加尤为突出，这说明具有苔藓纤维的锥体细胞是最易受损的神经元类型。癫痫组与对照组比较，Hsp22阳性表达细胞数差异有显著意义(P＜0.05)，癫痫1天组比癫痫7天组阳性细胞数明显增多，有统计学意义(P＜0.05)。蛋白印迹结果显示癫痫组中不同时间点Hsp22表达量均较对照组明显增高，其差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 2.caspase-3表达　　 caspase-3的激活是细胞凋亡的标志。免疫组织化学与蛋白质印迹结果均显示对照组海马caspase-3几乎不表达，癫痫组小鼠海马区caspase-3阳性表达细胞数随时间逐渐增多，癫痫组SE后第1天达到峰值，癫痫第3天至癫痫第7天caspase-3开始下降，表达不再上调。免疫组织化学染色显示CA3区和CA1区神经元caspase-3表达明显增高，说明CA3区与CA1区神经损伤最为严重，与Nissel染色结果提示CA3区和CA1区神经细胞缺失更明显一致。与对照组相比caspase-3表达差异有显著性意义(P＜0.5)。　　 结论：本实验研究发现热休克蛋白22在匹罗卡品致痫小鼠海马中稳定表达，提示热休克蛋白22对致痫小鼠的海马具有神经保护作用，能够抵抗癫痫持续状态对神经细胞的损伤作用，并可能起到细胞重构作用。