肺癌是当前全世界发生率及死亡率最高的恶性肿瘤,其中大部分是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC),但多数NSCLC患者确诊时已到晚期而无法手术切除,以铂类为基础的两药联合化疗方案和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor, EGFR-TKI)是当前针对EGFR基因非突变或突变的晚期NSCLC患者首选治疗措施。EGFR-TKI治疗具有用药方便、不良反应轻微等优点,但只有30%的晚期NSCLC患者EGFR基因突变者有可能从此治疗中获益。而且即使治疗有效的患者也多在用药后9个月左右出现耐药复发现象,延长患者生存期的作用有限。雷帕霉素及其类似物是一类新的小分子靶向治疗药物,其作用靶点是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白敏感型复合体(mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)。mTORC1由mLST8、mTOR、Raptor组成,其中mTOR是复合体的核心部分,位于EGFR/PI3K/Akt细胞信号通路的下游,通过调控更下游S6K1和4E-BP的磷酸化启动翻译信号使细胞周期由G1期向S期过渡。雷帕霉素可与FK结合蛋白(FK-binding protein, FKBP-12)竞争性结合形成FKBP-雷帕霉素复合物,该复合物与mTORC1的FKB域结合使mTORC1失活,阻断mTOR信号通路,抑制下游p70S6K1的磷酸化同时活化4EBP1,阻止mRNA翻译,使细胞生长停滞于G1期。雷帕霉素类似物tersirolimus (CCI-779)和依维莫司(everolimus, RAD001)已先后被批准上市用于晚期肾癌的治疗。我们推测,将作用于信号通路上游EGFR的抑制剂和作用于下游mTOR的抑制剂联合可能是针对NSCLC患者,特别是对吉非替尼原发或继发耐药患者的一种有效治疗方案。本课题通过对多种NSCLC细胞系进行药物敏感性及信号通路相关的实验,观察EGFR-TKI和mTOR抑制剂联合应用的效果并探讨其联合作用的机制。第一章吉非替尼和依维莫司联合应用对肿瘤细胞增殖的抑制作用方法采用MTT增殖抑制实验对细胞进行单药药敏实验以及观察不同方式的同时及序贯用药的抑制效果,采用CalcuSyn分析软件计算综合指数(combination index, CI)。建立多种单药或联合药物不同方案处理的细胞模型,采用western blot的方法检测多种靶向抑制剂对不同细胞模型的信号通路相关分子的影响。结果1用MTT法进行NSCLC细胞增殖抑制实验,确定了不同细胞对吉非替尼和依维莫司的IC50值。在实验中观察到不同细胞系对于吉非替尼的敏感性不同,IC50最大值与最小值相差700倍,IC50值分别为：A549 8.3±1.5μmol/L, H1650 14.9±0.2μmol/L, H1975 8.2±1.7μmol/L, HCC827 0.02±0.007μmol/L, PC-9 0.38±0.33μmol/L。实验结果表明A549、H1650、H1975为吉非替尼耐药细胞而HCC827、PC-9为敏感细胞。对于依维莫司的IC50,最大值与最小值相差为2.5倍,不同细胞系对依维莫司的IC50值分别为：A549 23.7±5.3μmol/L, H1650 9.3±1.2μmol/L, H1975 9.5±0.3μmol/L, HCC827 13.13±3.46μmol/L, PC-9 14.6±0.8μmol/L。2联合用药方案在吉非替尼耐药细胞系中表现出优于单药的抑制作用。对耐药细胞方案分别为同时G5+E (5μmol/L吉非替尼联合不同剂量的依维莫司),同时E5+G (5μmol/L依维莫司联合不同剂量的吉非替尼),序贯E→G5(不同剂量依维莫司作用24小时后换成5μmol/L吉非替尼作用48小时),序贯G→E5(不同剂量吉非替尼作用24小时后换成5μmol/L依维莫司作用48小时),采用析因分析的方法分别比较单药方案与同时和序贯两种方案间抑制效果的差别。结果显示,对于吉非替尼耐药细胞系,联合用药的抑制率和单药相比具有显著性差异(与吉非替尼单药相比：F=18.897,P<0.001；与依维莫司单药相比：F=16.555,P<0.001)。进一步采用析因分析比较两种联合方案间的差异,吉非替尼耐药细胞组中,当不同剂量的吉非替尼与5μmol/L的依维莫司联合应用时,同时用药方案组抑制率与序贯用药组相比差异具有显著性(F=11.883,P=0.003)；当不同剂量的依维莫司与5μmol/L的吉非替尼联合应用时,同时方案组与序贯组间抑制率无显著性差异(F=0.086,P=0.773)。3特定的联合用药方案可在吉非替尼敏感细胞系中表现出优于单药的抑制作用。当不同剂量的吉非替尼与5μmol/L的依维莫司联合应用时,同时方案组抑制率与序贯组相比无显著性差异(F=0.153,P=0.702)；当不同剂量的依维莫司与0.005μmol/L (HCC827)或0.01μmol/L (PC-9)的吉非替尼联合应用时,同时方案组与序贯组间抑制率相比较具有显著性差异(F=12.910,P=0.003)。4一定的浓度条件下,同时和序贯方案在耐药和敏感细胞中都可表现为协同效应。本实验中三种吉非替尼耐药细胞的同时及序贯用药实验在小剂量方案时都观察到了协同效应。但表现为中度和较弱的协同效应,随着药物浓度增加抑制效果逐渐增强,但CI值则增加至超过界值1,表明协同效应减弱甚至为拮抗。两种吉非替尼敏感细胞中,HCC827仅在低浓度的方案组合时表现为协同效应,随剂量增加其CI值增加表现为拮抗效应。而在PC-9细胞,则持续表现为明显的协同效应,各不同浓度组平均CI值均小于0.3。结论在对吉非替尼耐药和敏感的细胞系中,吉非替尼和依维莫司两药联合应用的方案可以增强单药的增殖抑制效果,抑制率随着药物剂量的增加而增大。但对于不同细胞系能达到最大抑制作用的联合方案有所不同；对于耐药细胞,两药同时的方案抑制效果更显著；对于敏感细胞,先给予依维莫司再给予吉非替尼的序贯方法抑制增殖效果最为明显。所有细胞系中,同时和序贯方案在小剂量水平的联合都具有协同效应,但随着药物浓度增加,协同效应减弱甚至可表现为拮抗。第二章吉非替尼和依维莫司联合应用对信号通路的影响方法建立吉非替尼耐药细胞模型,以及用不同的小分子靶向抑制剂处理细胞的模型,采用western blot的方法观察处理后信号通路不同分子磷酸化的改变情况。结果1采用western blot的方法,我们在敏感和耐药细胞系中都观察到吉非替尼对磷酸化蛋白p-mTOR及p-p70S6K有中度的抑制作用,增加依维莫司后,抑制作用明显增强。同时观察到吉非替尼、依维莫司单药及联合用药均对上述蛋白的磷酸化水平表现出时间依赖性抑制效果,24小时后可完全抑制其磷酸化。联合用药后可以有效地抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K和Ras/Raf/ERK/MAPK两条信号通路的相关位点而发挥联合抑制效应。2采用不同剂量的PI3K抑制剂LY294002对PC-9细胞进行了抑制实验。LY294002对p-EGFR、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K均表现出剂量依赖性的抑制作用,但对p-MAPK无明显抑制作用。而吉非替尼对p-MAPK的抑制作用明显并能维持较长时间,此效应是仅作用于P13K信号通路上的小分子抑制剂所不具备的,说明EGFR-TKI是联合方案中不可缺少的组成部分。依维莫司强化吉非替尼对p-mTOR和p-p70S6K的抑制作用,而吉非替尼抑制了依维莫司负反馈效应引起的p-Akt、p-MAPK活化,两种药物在抑制信号通路中发挥互补作用,从而实现了协同抑制作用。3我们通过药物浓度递增的办法诱导建立了吉非替尼耐药细胞系PC-9GR (gefitinib resistant)细胞系,经药物敏感性实验,此细胞系对吉非替尼的IC50超过初始PC-9细胞20倍以上,但对依维莫司的IC50仅为初始PC-9细胞的1.1倍,说明2种药物间无交叉耐药现象。通过敏感与耐药细胞对照的western blot实验可观察到,单独给予吉非替尼时PC-9GR细胞的p-EGFR仅被部分抑制,增加了mTOR抑制剂依维莫司后,能有效地增加对p-EGFR表达的抑制水平。此结果说明我们的两种药物联合可以有效地抑制继发性耐吉非替尼的NSCLC。结论在对吉非替尼敏感,原发或继发性耐药的的细胞系中,吉非替尼和依维莫司单药可抑制mTOR、EGFR、p70S6K等信号分子的磷酸化水平,联合应用的抑制效果优于任一单药。依维莫司对p-mTOR和p-p70S6K有明显的抑制作用,但对p-Akt或p-MAPK抑制作用不明显甚至可引起反馈性活化,联合吉非替尼可有效地抑制Akt和MAPK的磷酸化表达水平而且抑制p-MAPK的作用是仅作用于PI3K信号通路的小分子抑制剂所不能替代的。由此可见,吉非替尼和依维莫司两种药物在抑制信号通路中能够发挥互补作用,通过同时抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K和Ras/Raf/ERK/MAPK两条通路上的信号分子进一步影响蛋白质合成及功能,从而增强对肿瘤细胞的增殖抑制和杀伤作用。全文结论本文在多种对吉非替尼耐药和敏感的NSCLC细胞系中进行了吉非替尼与依维莫司同时及序贯方案联合应用的增殖抑制实验。在对吉非替尼耐药和敏感的细胞系中,吉非替尼和依维莫司两药联合应用的方案可以增强单药的增殖抑制效果,抑制率随着药物剂量的增加而增大。但对于不同细胞系能达到最大抑制作用的联合方案有所不同。从协同效应的角度而言,两药联合应用在小剂量水平可呈现出协同效应,但协同效应随着剂量增加而减弱甚至可表现为拮抗。这些结果提示对药物敏感度不同的NSCLC患者,需要从联合用药的方案和药物剂量两个角度考虑才‘有可能达到有效而不良反应较少的给药方法。采用western blot的方法分析了多种靶向药物单独或联合作用对PI3K/Akt/mTOR/p70S6K和Ras/Raf/ERK/MAPK两条通路上信号分子的影响,吉非替尼和依维莫司单药可抑制mTOR、EGFR、p70S6K等信号分子的磷酸化水平,联合应用时对这些位点的抑制作用进一步加强。吉非替尼可有效地弥补依维莫司对p-Akt和p-MAPK抑制作用不明显甚至可引起反馈性活化的缺点。仅作用于PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路的多种靶向药物联合不能有效抑制MAPK磷酸化表达水平,只有联合吉非替尼才能有效抑制p-MAPK,说明了吉非替尼在靶向药物联合方案中的重要性。吉非替尼和依维莫司联合应用的方案可通过抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K和Ras/Raf/ERK/MAPK两条通路上的信号分子进一步影响蛋白质合成及功能,从而增强对肿瘤细胞的增殖抑制和杀伤作用。