原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝肿瘤,亦是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。有关研究表明,原发性肝癌在确诊时,属中、晚期者居多,相当一部分病人由于肝癌发现较晚失去手术切除的机会或者在行肝癌根治性切除术后仍死于肝癌的复发转移。现有传统的生物标志物(Biomarker)对于肝癌的早期发现特别是术后复发有明显的局限性。因此,探索与肝癌发生相关的新的生物标志物对疾病的治疗和预防具有重大的意义。随着人类基因研究技术的发展,我们发现异常表达的lncRNA(Non-coding RNA,ncRNA)可通过不同途径和不同作用机制参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的各个阶段,是肿瘤进展的关键因素。生物信息学研究发现某些特定的lncRNA与其他表观遗传修饰存在错综复杂的调控关系进而在肿瘤的发生发展中起到重要的调控作用。既往研究揭示lncRNA-MEG3在肝癌肿瘤组织中存在异常表达的情况。本研究主要聚焦于探究可能造成肿瘤组织中lncRNA-MEG3异常表达的表观遗传修饰调控,lncRNA-MEG3在肝癌发生发展中起到的作用以及lncRNA-MEG3作为肿瘤标志物预测病人预后的潜在价值。此外,作为对上述实验研究的补充与升华,我们拟采用高通量芯片技术,进一步探究包括lncRNA-MEG3在内的长链非编码RNA的外周循环可溶性片段在肝癌病人与对照组外周血血浆中是否存在差异表达的现象,并探索这些差异表达的lncRNA作为生物标志物的潜能。在研究过程中,我们首先利用经典分子生物学技术循序渐进地在临床样本、分子层面、细胞层面、实验动物层面探究lncRNA-MEG3的表达异常与肝癌病人临床特性的相关性、可能造成lncRNA-MEG3异常表达的表观遗传学修饰调控机制、lncRNA-MEG3对肝癌生物学行为的影响以及该靶点作为病人预后生物标志物的应用价值。研究发现:相较于对应的癌旁组织,lncRNA-MEG3在肝癌患者肿瘤组织中存在明显的低表达现象。结合临床随访资料,我们发现lncRNA-MEG3高表达组中的肝癌病人预后要明显好于lncRNA-MEG3低表达组的病人。另外,COX多因素回归分析的结果也表明lncRNA-MEG3的表达有益于患者生存。随后,我们利用Chi-Square analysis等手段分析lncRNA-MEG3发现该长链非编码RNA的表达水平与肝癌患者肿瘤大小及TNM分期密切相关。通过一系列与肿瘤特性相关的体外与体内功能实验,我们发现肝癌细胞系内上调lncRNA-MEG3的表达可以显著的抑制细胞的增值能力。查阅已发表的相关研究报道我们了解在其他肿瘤组织中,lncRNA-MEG3可以通过对蛋白P53的募集与活化达成肿瘤细胞增殖能力的抑制。研究利用 Pearson 相关性分析(Pearson correlation analysis)与 Western blotting等技术发现在肝癌组织内也存在相似的调节作用。随后研究组造成lncRNA-MEG3异常表达的更上游调控机制进行了深入探究。利用一系列生物信息学预测及细胞功能试验等技术,我们发现在肝癌肿瘤组织中,受表观遗传学因子UHRF1负性调控的甲基化酶DNMT-1会特定的靶定于lncRNA-MEG3上游启动子序列中的CpG岛(CpG island),从而造成lncRNA-MEG3的表达被抑制。综合上述实验结果研究组得到结论:UHRF1/DNMT-1/lncRNA-MEG3/P53信号轴参与到肝癌的发生、发展当中,并在肿瘤的发病机理中发挥重要的调节作用。以往的研究表明,AFP作为经典的肝癌诊断标志物,在临床运用于肝癌的早期诊断时其特异性并未达到相关的期望水平。因此,探索全新的具有更高灵敏度及特异度的肿瘤标志物具有重要的临床意义。我们的前期数据提示,肿瘤生物标志物不仅可能来源于肿瘤,还可能来源于肿瘤细胞分泌后进入外周血循环的各种载体如外泌体等。承接上述课题,研究组在前期对于lncRNA-MEG3的相关临床研究及分析的基础之上,试图探究包括该lncRNA靶点在内的长链非编码RNA作为肝癌诊断相关血浆标志物的潜在应用价值。通过高通量转录组芯片技术在肝癌患者/健康对照血浆样本中进行长链非编码RNA筛选。我们发现:相较于健康对照,肝癌患者术前的外周血血浆样本中存在明显的lncRNA异常表达谱系;同时再次利用高通量转录组芯片技术在肝癌患者/健康人群血浆外泌体中进行长链非编码RNA筛选获取肝癌患者血浆外泌体中的lncRNA差异表达谱系。将上述两种lncRNA差异表达谱系进行交叉比对获取在两组表达谱系中表达情况类似的候选lncRNA,我们发现在上述课题中作为研究重点的lncRNA-MEG3并不包括在内,遂放弃了对其诊断价值的深入探究。随后,我们对候选lncRNA在随机临床样本中进行定量验证,证实高通量测序结果的准确性。紧接着通过ROC曲线分析等手段对上候选lncRNA的肝癌诊断价值进行分析,发现其表达水平与肝癌病人的转移存在一定相关性。我们挑选表达差异最为明显的lncRNA-MALAT1做进一步探究。结合RT-PCR技术与已发表的研究报道,研究组认为lncRNA-MALAT1高表达的外泌体的来源很可能是肝癌细胞。为探究患者血浆中lncRNA-MALAT1阳性的外泌体在肿瘤发生、发展中的作用,我们通过高通量转录组芯片技术对肝癌患者及健康对照外周血血浆中的外泌体进行mRNA表达谱分析。依据严格的生物信息学筛选标准,我们获取了 57个存在明显表达差异的mRNA,结合上述候选lncRNA-MALAT1的表达情况,进行LncRNA-mRNA共表达分析。结果表明候选mRNA靶点中GPC3与lncRNA-MALAT1的表达水平存在明显的关联。为了探究lncRNA-MALAT1于GPC3蛋白之间可能存在的调控机制,利用CYTOSCAPE等生物信息学软件我们发现lncRNA-MALAT1的核苷酸序列可能结合于GPC3蛋白氨基酸序列的数个区域,而其中氨基酸序列76-127区域(-N端)的得分最高,这提示lncRNA-MALAT1可能结合于GPC3蛋白氨基酸序列76-127区域发挥相应的调控作用。查阅UniProtKB/Swiss-Prot蛋白数据库,我们得知GPC3的蛋白氨基酸序列124(-N端)存在糖基化位点,而该位点的n-乙酰葡糖胺容易被体内包括肝细胞及外周血血浆中大量存在氨基葡萄糖苷酶NAG降解。通过查阅文献我们发现几乎所有内质网上合成的蛋白质最终被糖基化。糖基化的作用是:①使蛋白质能够抵抗消化酶的作用;②赋予蛋白质传导信号的功能;③某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。结合上述实验结果及理论,我们认为lncRNA-MALAT1在外泌体中的作用很可能是结合并覆盖于GPC3蛋白氨基酸的糖基化位点保护该位点的n-乙酰葡糖胺免于血浆内大量存在的氨基葡萄糖苷酶的降解,从而维持并促进GPC3蛋白的功能稳定。为了验证上述结论,通过 RNA 结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验我们证明lncRNA-MALAT1与GPC3蛋白存在结合。综合上述实验结果,研究组认为lncRNA-MALAT1与蛋白GPC3通过肿瘤细胞分泌的外泌体进入患者外周循环,lncRNA-MALAT1在此过程中结合于GPC3蛋白氨基酸位点促进并维持GPC3蛋白的糖基化,最终促进GPC3到达外周循环发挥相应的生物学作用。而通过查阅已发表的研究报道及综述我们发现,现有关于lncRNA参与调节肝癌发生发展的研究均局限于肿瘤细胞本身,以免疫细胞为着力点,研究lncRNA参与调控免疫细胞相关功能介导肿瘤发生、复发的探究仍罕有研究者涉足。另外,已经有研究者发现以外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)为主体,lncRNA可作为相关肿瘤发生及转移相关的标记物,外周血中PBMC的基因表达改变已被证明与肿瘤间质免疫微环境存在非常明显的相关性,而目前关于lncRNA介导下游信号因子参与PBMC的相关调控进而在肿瘤发生、发展中发挥生物学特性的研究仍未见相关报道,并且由外周血循环所引起的肿瘤靶器官内的肿瘤浸润单个核细胞内是否与PBMC间存在相同的调控机制目前仍是炎症介导肝癌发生转移机制研究中的空白。所以基于上述研究基础给出的提示,在接下来的研究中我们发现肝癌患者外周血PBMC中分选出的T细胞各亚群中的lncRNA-MALAT1及GPC3的表达明显高于健康对照人群外周血PBMC分选出的T细胞。随后研究组将Naive T细胞中lncRNA-MALAT1及GPC3的表达上调,分别向 Th17、Th1、Th2、调节性 T细胞(Regulatory T cells,Treg)进行诱导,检测各亚群T cell的分化情况,结果显示在幼稚性T细胞内上调lncRNA-MALAT1及GPC3后,Treg亚群细胞比例明显增多。随后通过蛋白芯片技术我们检测发现,相较于对照组幼稚T细胞,高表达lncRNA-MALAT1与GPC3的幼稚T细胞内PI3K/AKT/mTOR通路明显被抑制,而最近越来越多的研究表明,抑制PI3K/AKT/mTOR通路能促进诱导性调节T细胞产生。结合已发表的研究报道,我们了解到诱导性调节T细胞的大量增殖、分化将会促使肿瘤免疫微环境向抑制性免疫微环境方向转化,促进人体免疫系统对肿瘤细胞识别、杀灭效率的减弱,并最终促成肿瘤的发生、发展。综合上述实验结果及理论,我们认为肝癌患者肿瘤细胞内大量表达的lncRNA-MALAT1达成对蛋白GPC3的活化并最终一并“包装”进入肿瘤细胞分泌的外泌体囊泡到达并进入肿瘤免疫微环境及外周血血浆,而活化后的GPC3进入肿瘤浸润炎症细胞中参与抑制PI3K/AKT/mTOR通路并最终促进炎症细胞中幼稚T细胞向Treg分化,以促进下游细胞因子白细胞介素的持续释放,在炎症细胞中发挥持续介导炎症发生,从而达成促进肿瘤发生、发展的目的。我们的研究对原发性肝癌的发生发展相关的长链非编码RNA,特别是肿瘤细胞来源外泌体所携带的长链非编码RNA及下游信号分子参与调控肿瘤免疫微环境这一动态过程进行了广泛而深入的探讨,为深度理解该过程中复杂的信号调控提供了新的思路与视角。