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目的:检测流感病毒(H1N1)血凝素对内皮细胞组织因子(Tissue factor,TF)表达的影响,通过探讨其对血管内皮细胞组织因子基因和蛋白水平的影响,进一步探索流感病毒血凝素对小鼠肺脏产生的病理改变。本研究探讨流感病毒血凝素对肺血管内皮细胞表达TF的影响,今后将进一步研究对TF的高表达有重要影响的因素及相关通路,并深入研究其与流感重症肺炎患者最后出现DIC的密切关系,为下一步开发抑制TF活性的有关物质提供依据,以期为阻断流感病毒感染发展为流感重症肺炎的致病机制提供新思路。方法:1体外实验:1.1外购Bend3细胞系,并传代培养,后随机分取三组,分别饥饿细胞12小时,第一组:生理盐水(0μg/ml)刺激Bend3细胞作为对照组;第二组和第三组:不同浓度(2.5μg/ml和5μg/ml)流感病毒血凝素刺激Bend3细胞作为实验组。均在作用12小时后,分别收取三组细胞总蛋白,通过Western Blot实验验证12小时后TF在蛋白水平上的变化,测量Western blot所得结果的灰度值进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。1.2培养Bend3细胞,后随机分取三组,分别饥饿细胞12小时,第一组:生理盐水(0μg/ml)刺激Bend3细胞作为对照组;第二组和第三组:不同浓度(2.5μg/ml和5μg/ml)流感病毒血凝素刺激Bend3细胞作为实验组。均在作用12小时后,分别收取三组细胞总RNA,通过Real-time PCR实验验证12小时后TF在基因水平上的变化,以P<0.05为差异有统计学意义。2体内实验:将18只SPF级BABL/c小鼠(雌雄各半,雄性9周龄,雌性8周龄,体重一致),随机分为三组,每组六只。第一组:生理盐水(0μg/ml)对照组,第二组和第三组:不同浓度(2.5μg/ml和5μg/ml)流感病毒血凝素组。按小鼠2ml体液量换算后沿尾静脉向小鼠体内注入生理盐水及不同浓度(2.5μg/ml和5μg/ml)流感病毒血凝素,注射完毕后,做好标记,将小鼠放于饲养笼中,自由进水、进食。观察12小时期间,小鼠的行为学改变和12小时后剖检观察小鼠肺组织并留取小鼠肺组织通过显微镜观察HE染色后小鼠肺组织的病理变化。结果:1体外实验:1.1 Western blot结果实验结果显示,TF在各组Bend3细胞中均表达,不同浓度(2.5μg/ml和5μg/ml)流感病毒血凝素刺激作用下Bend3细胞TF在蛋白水平上调,均显著高于生理盐水(0μg/ml)对照组,其中流感病毒血凝素(2.5μg/ml)实验组TF表达与生理盐水(0μg/ml)对照组比P=0.009(P<0.05),流感病毒血凝素(5μg/ml)实验组TF表达与生理盐水(0μg/ml)对照组比较P=0.000(P<0.05)。1.2实时PCR结果实验结果显示:TF在各组Bend3细胞中均表达,流感病毒血凝素(2.5μg/ml)实验组TF表达与生理盐水(0μg/ml)对照组比P=0.586(P>0.05),差异无统计学意义;流感病毒血凝素(5μg/ml)实验组TF表达与生理盐水(0μg/ml)对照组比较P=0.019(P<0.05)。流感病毒血凝素刺激作用下Bend3细胞TF在基因水平上调,显著高于生理盐水(0μg/ml)对照组。(表2,图3)2体内实验:动物实验结果:我们在流感病毒血凝素注入小鼠体内12小时期间进行行为学观察,12小时后立即同时麻醉处死三组小鼠对肺组织进行剖检观察并留取肺组织通过HE染色技术后进行显微镜观察。2.1行为学观察:三组小鼠在注射不同浓度病毒血凝素(0μg/ml,2.5μg/ml和5μg/ml)12小时期间,每隔一小时,每次10分钟,观察一次小鼠的状态,均未能观察到明显行为学变化;2.2剖检观察:生理盐水(0μg/ml)对照组的小鼠肺脏组织呈现出淡粉红色,质地较柔软,肺叶光滑润泽;不同流感病毒血凝素(2.5μg/ml和5μg/ml)实验组小鼠的肺脏均呈现出暗红色,肺叶出现表面粗糙,有的局部呈轻度实变,有斑点状充血和渗出现象。2.3显微镜观察:通过HE染色技术对小鼠肺脏组织病理损伤评估,生理盐水(0μg/ml)对照组的小鼠的肺泡上皮细胞形态基本正常,没有实变区,肺泡也均匀没有萎缩或扩张现象,没有充血、渗出以及炎细胞浸润;不同流感病毒血凝素(2.5μg/ml和5μg/ml)实验组小鼠肺组织呈现出明显的病理损伤变化,包括肺泡结构的破坏,肺泡间隔的增宽和肺组织弥漫性的损伤、充血、凝血以及水肿并伴有大量炎症因子浸润等病理性改变。(图4)结论:1.流感病毒血凝素能使内皮细胞组织因子基因和蛋白水平上调。2.体内动物实验进一步证实了流感病毒血凝素导致小鼠体内出现肺脏凝血系统及组织炎症性病理损伤等改变。