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缺血性心肌病是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一,而在该疾病的治疗过程中缺血再灌注性损伤一直是困扰其临床疗效的重要原因。寻找有效的预防和治疗方式具有重要的临床价值。心肌缺血预处理是目前已知的通过激活机体自身的内源性保护机制从而发挥心肌保护作用的最有力治疗方法,但囿于其临床操作的不便性,极大地限制了其在临床的推广和应用。基于传统中医“治未病”思想形成的针刺预治疗的治病方式,越来越受到人们的重视,其也是通过激活人体自身内在保护的调节机制达到防病治病的目的。针刺预治疗本身操作简便易行,而且经济、副作用小,具有较高的临床推广和应用价值。过去的临床试验也证明,针刺预治疗可以改善缺血再灌注损伤,减少心肌梗死面积,降低心律失常的发生和疾病死亡率。我们前期的实验研究也表明针刺预治疗能够“模仿”缺血预处理发挥对缺血心肌的保护作用,但是针刺预治疗发挥作用的具体机制尚不明确,不利于其临床的推广。大量的实验证据表明,AR2b可能在心肌缺血再灌注的保护作用中起关键性的作用,而针刺预治疗被证明能够调节心肌腺苷及其受体的表达,因此针刺预治疗改善缺血再灌注损伤极有可能与AR2b受体的调节有关。心肌钙超载是导致缺血再灌注损伤的重要原因之一,相关研究表明AR2b受体参与细胞内钙离子的调节,那么围绕AR2b及心肌细胞内钙信号调节的关键节点,探讨针刺预治疗改善缺血性心肌损害的作用机制,将为针刺预治疗预防和改善缺血性心肌病提供有力的科学证据和新的治疗思路,促进针刺预治疗的临床推广,同时彰显中医“治未病”的预防思想在解决世界医学难题中的重要性。目的:在确定电针预治疗改善心肌缺血再灌注损伤疗效的基础上,验证AR2b是否参与介导电针预治疗对心肌缺血再灌注的保护作用,并进一步探讨AR2b是否通过影响与心肌细胞内钙调节相关的关键因子的表达,进而介导缺血性心肌的相关保护作用。方法:本实验研究共分为两阶段进行。第一部分主要探讨针刺预治疗对缺血再灌注损伤的保护作用,并确定AR2b是否参与介导电针预治疗对心肌缺血再灌注的保护作用:将48只雄性大鼠随机分为正常对照组(NC)、模型组(M)、电针预治疗组(EA)、电针+AR2b拮抗剂预治疗组(EAG)。NC组不结扎、不电针,而其他组均接受缺血/再灌注处理。EA组在造模前连续给予电针预治疗3天,EAG组在每次给予电针预治疗前30 min进行腹腔注射AR2b受体拮抗剂。分别以心电图ST段改变,心律失常评分,反映心脏功能的血流动力学指标LVEDP、EF、dp/dt max、ESPVR和EDPVR以及反映心肌梗死面积的Evans blue-TTC染色等效应指标来确定电针预治疗对缺血性心肌损伤的保护作用。确定疗效以后,给予AR2b受体特异性阻断剂(GS6201)进行预处理,然后采用荧光Western Blot法检测缺血心肌损伤局部AR2b蛋白的相对表达量,同时结合上述效应指标,确定AR2b是否参与了介导电针预治疗对心肌缺血再灌注的保护作用。第二部分主要研究AR2b受体介导电针预治疗改善心肌缺血再灌注损伤的机制研究:采用多重荧光Western Blot法分别检测缺血心肌局部组织中各种心肌细胞内钙调节关键因子如 Ryanodine receptor 2、NCX1、SERCA2a、PLB、P-PLB 蛋白的表达,探讨AR2b是否通过影响心肌细胞内钙调机制的关键蛋白,从而介导电针预治疗改善心肌缺血性损害。结果:1.AR2b介导的针刺预治疗对缺血再灌注损伤的保护作用(1)各组心电(ECG)变化:M组ST段在结扎后各时间点与NC组的相应时间点比较均显著升高(P均<0.01),EA组结扎即刻ST段水平与NC组比较虽亦有显著抬高(P<0.01),但在缺血及再灌注各时间点,其ST段逐渐回归基线,尤其在缺血30min和再灌注15min时与M组的相应时间点ST段水平比较均有显著下降(P<0.05,P<0.01),结扎30min及再灌注15min,EAG组ST段水平均显著高于EA组(P均<0.01)。(2)各组心律失常评分:与NC组相比,M和EAG组心律失常评分显著性升高(P<0.01),而EA组较M组评分显著性降低(P<0.01),EAG组较EA组评分升高(P<0.05)。(3)各组心肌TTC-Evans blue染色结果:与NC组比较,M组的梗死面积较明显。EA组心肌的梗死面积明显小于M组,EAG组梗死区/危险区显著高于M和EA组。(4)各组心脏功能的血流动力学指标:①LVEDP的变化:NC组大鼠心功能各时间点LVEDP与M组、EA组比较均无统计学差异(P>0.05)。EAG组在结扎15min、30min,其LVEDP水平均高于 NC 和 EA 组(P<0.05)。②EF的变化:结扎15min时,NC组与EA组比较无明显差异(P>0.05),而M和EAG组EF值均较NC组有所下降(P<0.05)。M组、EA组和EAG组的EF值在结扎30min、再灌注15min时,均较NC组显著降低(P<0.01),呈持续性降低趋势。再灌注15min时,M组的EF值低于EA组(P<0.05),但是显著高于EAG 组(P<0.01)。③dp/dt max的变化:与NC组相比,在结扎15min时EA组dp/dt max值变化不明显,M组和EAG组dp/dt max值均显著降低(P<0.01),而在结扎30min和再灌注15min时,M组、EA组、EAG组dp/dtmax值均显著降低(P<0.01)。再灌注15min时,EAG组dp/dt max值显著低于EA组(P<0.01)。④ESPVR和EDPVR的变化:再灌注15min结束后,与结扎前斜率(Ees)比较,NC组无明显变化(P>0.05),M组、EA组、EAG组均显著降低(P<0.01),且NCEes>EAEes>MEes>EAG Ees。在结扎前,NC、M、EA 组大鼠 EDPVR 的斜率Eed无明显差异(P>0.05),而EAG组Eed较前三组水平显著升高,而再灌注15min结束后,与结扎前斜率Eed 比较,NC组无明显变化(P>0.05),M组、EA 组、EAG 组均显著升高(P<0.01),且 NC Eed<EA Eed<M Eed<EAG Eed。(5)实验各组大鼠缺血心肌损伤局部组织中AR2b蛋白的相对表达:M组AR2b的相对表达量较NC组显著升高(P<0.01)。针刺预治疗后,EA组AR2b相对表达量最高,显著高于M组(P<0.01)。而EAG组AR2b表达受到显著抑制,较EA组显著降低(P<0.01)。2.心肌细胞内关键钙调因子参与AR2b介导针刺预治疗保护缺血性心肌的机制研究①RyR2蛋白表达量变化 NC组大鼠心肌组织中RyR2相对表达量较低,而M组造模完成后RyR2表达量显著升高(P<0.01),电针预治疗后EA组RyR2表达较M组显著性降低(P<0.01),但其相对表达量仍高于NC组。而EAG组RyR2表达量较NC、EA组均升高(P<0.01),但表达量较M组有所降低。②PLB、P-PLB(S16)及P-PLB/PLB比值的变化 EA组和EAG组PLB的相对表达量较NC和M组都显著性降低(P<0.01),M组、EA组和EAG组的P-PLB(S16)蛋白相对表达量显著性降低(P<0.01),而EA组表达量较M组升高,EAG组表达量最低(P<0.01)。与NC组相比较,M和EAG组P-PLB/PLB的比值均显著性降低(P<0.01),而EA组的比值显著性升高(P<0.01)。与EA组相比较,EAG组的比值则显著性降低(P<0.01)。③NCX1蛋白表达量变化 M组、EA组和EAG组与NC组相比较,NCX1的相对表达量变化不明显(P>0.05),EAG组NCX1相对表达量较M组降低(P<0.05)。④SERCA2a蛋白表达量变化 M组SERCA2a相对表达量较NC组显著性降低(P<0.01),而EA组较M组升高(P<0.05)。结论:(1)电针预治疗能够有效地减轻心肌缺血再灌注导致的损伤,降低心肌的梗死面积,改善缺血心脏的功能。(2)AR2b的拮抗剂能够阻断针刺预治疗的心肌保护效应,表明AR2b参与了介导电针预治疗对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。(3)电针预治疗能够降低心肌缺血再灌注导致的损伤,其机制可能是通过促进AR2b的表达,进而影响细胞内钙调关键因子,抑制RyR2、PLB的相对表达量,增加P-PLB(S16)及SERCA2a的表达量,减轻心肌细胞缺血再灌注时钙超载的发生。