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目的:皮肤黑素瘤是由黑素细胞产生的一种侵袭性强,恶性程度高的皮肤肿瘤,尽管皮肤黑素瘤发生率低于鳞状细胞癌和基底细胞癌,但其致死率却远高于两者,且呈逐年增高的趋势。据统计,每年全球新发皮肤黑素瘤患者约16万,死亡率可达30%。手术切除是早期黑素瘤治疗的首选,而当肿瘤进展至晚期或复发时,平均生存期则不足9个月,5年生存率也低于5%。近年来,由于生物试剂和免疫调节剂的应用,使黑素瘤的治疗方案更加完善,同时也进一步提高了黑素瘤的生存率。热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）,又称应激蛋白,是一种功能保守,存在于几乎所有生物细胞中的蛋白。其作为分子伴侣通过协助蛋白质的适当折叠,保护细胞免受外界环境因素的损害,参与细胞的生长分化、新陈代谢及信号传导的调控;此外,也可以帮助隔绝损伤蛋白并使其降解。HSPs主要的生物学功能是在应激状态下保护细胞生命活动,维持细胞生存的必需蛋白质。根据HSP分子量及序列同源性的差异,将其分为三大类,包括HSP90、HSP70、HSP40（DNAJ）和一些小分子的HSP（HSPB）。多篇文献报道HSP90和HSP70在黑素瘤组织中的表达高于色素痣,且主要定位于细胞核内。随着研究的不断深入,发现HSPs家族广泛存在于黑素瘤组织中,并与肿瘤的分级、预后及生存时间密切相关,提示我们HSPs很可能在黑素瘤中发挥重要作用,并可作为疾病预后及治疗的靶点。温热疗法是一种利用物理性刺激作用于人体使体温升高达到治疗疾病的方法,范围常在40-44℃间,时间约为30-60分钟。该作用温度对细胞具有毒性作用,且可引起周围环境低氧及低PH值,造成组织灌流量不足。随着研究的不断深入及控温技术的逐渐发展,温热疗法已成为治疗肿瘤性疾病最主要的辅助手段。大量证据显示温热不仅可提高肿瘤细胞免疫原性,促进抗原提呈细胞提呈功能,增强NK细胞及巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力,尚可通过影响细胞有丝分裂及促进凋亡参与肿瘤细胞生物学功能的调控。尽管研究发现温热可提高放化疗的敏感性及某些抗癌药物的细胞毒性,但临床资料总结显示,尚有较高比例的肿瘤患者对温热治疗无反应,治疗效果欠佳。因此,明确温热作用的相关分子机制,通过体外干预,增强人工诱导抗肿瘤的作用,具有较高的临床实用价值。研究发现,温热疗法可引起热休克蛋白表达的增加。临床中也成功利用HSPs的抑制剂有效阻断了胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌和膀胱癌的进展,促进肿瘤细胞凋亡,增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。课题组前期研究发现温热联合敲除HSPB1可增加单一治疗方案对黑素瘤细胞的杀伤作用,提示联合方案在临床治疗黑素瘤中具有重要的价值。同时通过PCR array结果分析发现温热前后,小鼠黑素瘤B16细胞中DNAJB1和DNAJA4 mRNA表达显著增加。鉴于以上研究结果,本研究目的为:观察DNAJB1和DNAJA4在黑素瘤组织中表达;观察温热治疗前后DNAJB1和DNAJA4的表达以及DNAJB1和DNAJA4在黑素瘤细胞中的作用及可能的分子机制,寻找增强温热治疗效果的靶点。材料与方法:1.实验对象:石蜡组织切片标本来自中国医科大学附属第一医院皮肤科20132016年存档的石蜡组织包埋标本,经病理组织学结果证实为黑素瘤。正常对照组织来自皮肤科色素痣的石蜡组织包埋标本。体外温热组织标本来自于中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊,病理诊断为黑素瘤的患者,留取其行病理活检后废弃的组织。患者或其监护人知情同意,获得中国医科大学附属第一医院机构审查委员会批准,并符合赫尔辛基宣言。细胞系选择为黑素瘤细胞系（小鼠B16细胞系,人HTB140、A375和A2058）作为研究对象。2.温热治疗方案:体外温热组将黑素瘤组织一式二份,全部浸润至培养基中,分别给予37℃和45℃水浴锅加热30分钟,常规培养8小时。细胞温热组方法同体外温热。3.免疫组织化学检测相关蛋白:石蜡组织切片4μm,采用免疫组织化学染色技术（ABC法）检测DNAJB1和DNAJA4表达。切片经脱蜡、抗原修复、一抗、二抗、DAB显色、复染并拍照,在20倍物镜下随机选取3个视野,利用Image-pro Plus软件分析平均光密度值。4.Real-time PCR检测DNAJB1和DNAJA4 mRNA的表达:采用实时荧光定量PCR方法检测DNAJB1和DNAJA4 mRNA的表达。按Qiagen提取试剂说明书提取总RNA;GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒反转录合成cDNA;采用GoTaq○R qPCR Master Mix试剂盒行进行实时荧光定量PCR扩增并对结果进行半定量分析。5.Western blot检测DNAJB1和DNAJA4蛋白的表达:采用Western blot方法检测温热前后DNAJB1和DNAJA4蛋白表达水平的变化。选用RIPA裂解液提取细胞中蛋白;BCA方法检测蛋白质浓度;经制胶、电泳、转膜、牛奶封闭、一抗过夜、二抗孵育、ECL显色和拍照,观察蛋白表达变化。6.MTS检测细胞增殖:采用MTS方法检测DNAJB1或DNAJA4联合温热对细胞增殖的影响。将敲除Dnajb1或Dnaja4的基因组和空白对照组细胞接种于96孔板中,给予温热处理后,分别于第0天、1天、2天、3天和4天采用酶标仪检测,490nm处观察吸光度值。7.流式细胞术检测细胞周期和凋亡:利用流式细胞术检测DNAJB1或DNAJA4联合温热对细胞周期和凋亡的影响。将敲除DNAJB1或DNAJA4的基因组和空白对照组细胞接种于六孔板中,给予温热处理后,采用APC凋亡试剂和PI试剂分别检测细胞凋亡的变化和周期的分布。8.统计学分析:利用GraphPad Prim软件对数据进行统计学分析。仅有两组数据时测得结果采用（?）±S表示,比较采用paired t test或Mann-Whitney test。超过两组数据比较时采用方差分析。P<0.05时具有统计学差异。结果:1.DNAJB1和DNAJA4在黑素瘤组织中的表达:利用免疫组织化学方法观察DNAJB1和DNAJA4在浸润深入不同的黑素瘤组织和色素痣组织中的表达情况。结果显示,DNAJB1和DNAJA4在色素痣和小于1mm的黑素瘤组织中呈弱阳性或阳性表达,而两者在大于1mm的黑素瘤组织中表达量均明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.温热对黑素瘤细胞和组织中DNAJB1和DNAJA4表达的影响:小鼠B16细胞系和三种不同的人黑素瘤细胞系（HTB140、A375、A2058）,经37℃和45℃处理后,细胞中DNAJB1和DNAJA4表达水平增加,且呈时间依赖性。黑素瘤患者皮损体外温热后DNAJB1和DNAJA4变化水平同上,但具有明显的个体差异。3.温热联合敲除DNAJB1或DNAJA4对黑素瘤细胞生物学功能的影响:敲除DNAJB1或DNAJA4的黑素瘤细胞经温热处理,细胞生长抑制作用明显高于单一刺激因素,凋亡比例增加,细胞周期分布紊乱。结论:1.DNAJB1和DNAJA4的表达可能与黑素瘤的发生、发展及预后密切相关,具有重要的临床与科研价值。2.温热可提高黑素瘤细胞中DNAJB1和DNAJA4的表达,且呈时间依赖性。3.温热联合敲除DNAJB1和DNAJA4可明显增加单一刺激因素对黑素瘤细胞增殖、周期分布和凋亡影响,可有效降低黑素瘤细胞的耐热性,提示温热联合敲除DNAJB1或DNAJA4具有临床治疗黑素瘤的重要价值。