前言 铜绿假单胞菌所致的慢性呼吸道感染是目前临床上常见且十分难治的一种感染，其难治性往往与生物被膜(biofilm，BF)的形成有关。BF是指细菌被自身分泌的多糖基质包绕，彼此粘连并且粘附于各种表面或界面所形成的细菌群落。BF可以保护细菌逃避宿主的免疫和抗菌药物的杀伤作用，即使应用对铜绿假单胞菌十分敏感有效的抗生素，BF菌亦很难清除，临床治疗十分棘手。 迄今为止，国内对BF的研究多局限于体外模型的设计和应用，而体内模型则更有利于综合考虑内环境的影响，并可探讨宿主因素对BF形成的影响及体内BF菌耐药机制。本实验用吸入法建立铜绿假单胞菌肺感染BF模型，研究体内细菌BF的组织学及细菌学特征，并进一步应用药物进行干预，观察药物对肺部BF菌感染的作用，为防治此类感染提供依据。 实验方法 1．铜绿假单胞菌肺感染BP模型的建立及观察 (1)吸入法建立铜绿假单胞菌BF模型。将50只豚鼠分成四个组：A组10只，为吸生理盐水组，作为BF模型的对照；B组30只，为BF模型建立组；C组和D组为抗生素干预组，每组5只，C组单用头孢噻肟组，D组合用头孢噻肟与罗红霉素。所有动物均事先应用地塞米松抑制免疫(3mg／kg／日)，日一次，连用7天。将事先配好的浓度为6.25×10~8CFU／ml的铜绿假单胞菌菌悬液通过喷雾器以气雾剂的形式，接种至豚鼠肺内，A组接种生理盐水。每组均喷雾接种40分钟。A组于接种后第3天和第7天取材F组于接种后第3、7、10＼14、17及21天分别取材，C组和D组于接种后第10天取材，每组每日各取5只动物。 p）感染肺组织（标本）取出后活菌计数。无菌取出一侧肺组织，用灭菌生理盐水经支气管灌注冲洗，去除浮游菌。称重后，置于组织匀浆器内匀浆，加人lml灭菌生理盐水制成组织悬液，再做IO倍系列稀释，分别取各稀释度标本IO山接种于血琼脂平板上，37℃过夜培养后计数菌落数。 橱）普通光学显微镜及扫描电镜观察。另一侧肺组织取出后，一部分用10％福尔马林溶液固定对E染色，用普通光学显微镜观察。另一部分标本则以2．5％戊二醛溶液固定，液氮冷冻断裂并经系列处理后，用扫描电镜观察。 2．抗生素干预 实验分三组，包括接种铜绿假单胞菌后不用抗生素组（B组人单用头饱暖股组＊组）以及合用头抱噬股与罗红霉素组①组人C组及D组动物于接种后第7天开始分别应用抗生素治疗，连用3天。其中头抱喀能每日两次次下注射给药问 昨g／日入罗红霉素则每日两次口服给药瞩 日八三组动物均于接种后第10天取材。标本取出后作上述同样处理。 3．统计方法：资料的性质为计量资料，且需进行组间两两比较，故采用方差分析SNK检验，用SPSS软件分析处理。 实 验 结 果 互．B组有三只动物于接种后第1天死亡，其它各组动物无死亡。 2．铜绿假单胞菌肺感染BF模型的观察 门则组动物于取材日肺组织培养均见铜绿假单胞菌生长， ·2·第 10天时菌落数最多，为 5．25 X 10丫FU／l，第 ZI天时有所减少，为 4．07 X 10’CFU／Inl。A组无细菌生长。 p）普通光学显微镜观察／组动物肺组织除早期局部有少许炎性细胞浸润外，未见明显异常。B组动物肺组织则在接种后第3天开始于实变区域内出现散在分布的结节，结节主要由炎性细胞组成，以淋巴细胞为主。接种后第7天及14天时，肺内实变明显减轻，结节的大小同前比较增大，数目增多，外周包绕扁平的类上皮细胞和成纤维细胞，呈现慢性肉芽肿样结构，并且多分布在肺边缘近胸膜处。到第21天时，肺内肉芽肿结节仍存在，结节的大小较先有所减小，数目亦减少。 p）扫描电镜下见结节内存在大量细菌，菌体被粘液样基质包绕并彼此连结，中间镶嵌有淋巴细胞。随着时间的延长，基质的厚度增加。 3．抗生素干预的结果 C组和D组动物同B组比较肺组织菌落数均减少，但C组与B组比较，统计学上差异不显著对组同B组相比则存在显著性差异。联合用药后，光镜下结节明显变小，数目减少，电镜下见BF基质的厚度明显变薄；而单用头抱噬防组的结节大小及数目在F基质厚度的变化则不明显。 讨 论 1．吸人法建立的肺感染模型同临床慢性肺部感染性疾病相接近，有着重要的临床意义。免疫抑制剂的应用是本实验模型建立的前提，在接种细菌之前应用免疫抑制剂可以促进吸人细菌在肺内的定植，临床观察亦发现往往免疫功能低下的病人容易形成BF感染。国外文献建立铜绿假单胞菌肺感染模型时用醋酸可的松抑制免疫，我们在预实验中用氢化可的松替代，药物用量大门0mg／ ·3·kg／日X给药部位组织坏死明显。后改用地塞米松，药物用量较小O mg／kgi日X局部反应轻微，免疫抑制作用亦肯定。定植在肺内的细菌即以BF的形式在体内长期存在，形成一种稳定的慢性感染。本实验建立的模型可用于较长期的实验研究。 2．国外文献?