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背景:目前,心血管疾病的发病率越来越高,已成为严重威胁人类健康的疾病之一,因此,如何防治心血管疾病已成为重要任务。然而,在心血管疾病的治疗中极易发生心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤。当心肌发生I/R损伤时,将极大的加重心肌纤维化,扩大梗死面积,促进炎症反应,致使心功能下降和心力衰竭,从而诱发患者死亡。因此,越来越多的研究致力于探讨如何减少心肌I/R损伤,进而促进心血管疾病的治疗。目前研究发现心肌I/R损伤的病理生理机制非常复杂,除了细胞内发生钙超载、炎症、氧化应激、凋亡等外,焦亡也参与了心肌I/R损伤的病理过程。焦亡是一种特殊的程序性死亡方式,主要通过NLRP3炎性小体的触发以及ASC、Caspase-1的活化诱发,因此,研究中要证实细胞是否发生焦亡多采用检测细胞NLRP3、ASC以及Caspase-1基因和蛋白的表达。此外,细胞焦亡伴有炎症级联反应,通过激活NLRP3炎症小体并介导一系列的下游反应,形成有活性的炎症因子IL-1β和IL-18,从而导致细胞损伤。而CHIP是E3泛素连接酶中的成员之一,高表达于人心血管系统组织,CHIP通过加快异常蛋白质的修复,维持心肌Ca2+稳定,抑制氧化应激,抑制细胞凋亡、自噬等对心肌发挥保护效应。此外,CHIP除了具有这些作用外,还具有抗炎作用。因此,我们推测CHIP可能也具有抗焦亡作用,为了验证这一假设,本研究中我们通过对心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）处理,建立心肌I/R损伤的体外模型,从而探讨CHIP对H/R诱导的心肌细胞焦亡的影响,明确CHIP的具体作用机制,为进一步改善患者心肌I/R后的临床预后及减轻心肌I/R损伤提供新的治疗思路。第一部分CHIP下调对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响目的:探索CHIP下调对缺氧/复氧介导大鼠心肌细胞焦亡的影响并初步探究其分子机制。方法:（1）选用10只出生1-3天的Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠,从中提取原代心肌细胞。分成4组:1组:N+siRNA NC组,2组:N+siRNA CHIP组,3组:H/R+siRNA NC组,4组:H/R+siRNA CHIP组。应用LV-CHIP-RNAi和LV-NC慢病毒转染原代心肌细胞;通过将原代心肌细胞先放在缺氧小室中8h,之后放于常规培养箱中复氧2h,构建该细胞缺氧/复氧损伤模型。（2）实验处理完毕后,收集各组上清液,检测其乳酸脱氢酶（LDH）水平、CCK-8试剂盒检测各组细胞活力及细胞增殖率、ELISA试剂盒检测IL-1β的表达;Hoechst 33342/PI双重染色法检测细胞焦亡染色、RT-PCR实验检测心肌细胞NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA水平。蛋白印迹检测NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、CHIP以及HSF1蛋白表达水平。结果:1、在显微镜下观察,体外培养的原代心肌细胞,形态呈三角形或不规则多边形,培养3天后大部分细胞融合生长,细胞融合约达80%,视野内可见大部分细胞同步有力搏动,搏动频率约为60次/分。各组细胞经不同处理后观察形态及数量变化。可见H/R培养介导心肌细胞形态改变,细胞数量较对照组减少;与H/R+siRNA GFP组相比,H/R+siRNA CHIP组心肌细胞形态改变更明显,细胞数量减少。各实验结果（1）与N+siRNA GFP组相比:H/R+siRNA GFP组心肌细胞上清液LDH水平增高;CCK8试剂盒检测结果显示,细胞活力下降,心肌细胞增殖率显著降低,Hoechst 33342/PI双染色法检测结果进一步提示,心肌细胞焦亡指数明显增加,NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA表达水平上升,NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1β蛋白表达水平上调,统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。（2）与N+siRNA GFP组相比:N+siRNA CHIP组心肌细胞上清液LDH、细胞活力无明显差别;Hoechst 33342/PI双染色法检测结果提示,心肌细胞焦亡指数无明显变化;NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA水平无明显改变;NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平无明显改变。统计分析发现:以上差异均无统计学意义。CHIP、HSF1以及β-catenin蛋白表达水平明显下降,有统计学意义（p<0.05）。（3）与H/R+siRNA GFP组相比:H/R+siRNA CHIP组心肌细胞上清液LDH水平进一步增高;CCK8试剂盒检测结果显示,细胞活力进一步下降,心肌细胞增殖率显著降低;Hoechst 33342/PI双染色法检测结果进一步提示,心肌细胞焦亡指数进一步明显增加,NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA水平上调,NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平上调,CHIP、HSF1以及β-catenin蛋白表达水平明显下降。统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:缺氧/复氧可介导心肌焦亡损伤,下调CHIP表达加重缺氧/复氧介导的心肌焦亡。第二部分CHIP过表达对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响目的:探索CHIP过表达对缺氧/复氧介导的心肌焦亡的影响。方法:（1）选用10只出生1-3天的SD大鼠乳鼠,从中提取原代心肌细胞。分成4组:1组:空白对照+慢病毒载体（N+GFP）组、空白对照+重组CHIP（N+CHIP-GFP）组、缺氧/复氧+慢病毒载体（H/R+GFP）组、缺氧/复氧+重组CHIP（H/R+CHIP-GFP）组。应用慢病毒载体介导原代心肌细胞过表达CHIP,建立过表达CHIP的原代心肌细胞。通过将原代心肌细胞先放在缺氧小室中8h,之后放于常规培养箱中复氧2h,构建该细胞缺氧/复氧损伤模型。（2）检测各组上清液中指标同上一部分。结果:（1）与N+GFP组相比:H/R+GFP组心肌细胞Hoechst 33342/PI双染色法检测结果进提示,心肌细胞焦亡指数明显增加;NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA水平上调;NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平上调。统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。（2）与N+GFP组相比:N+CHIP-GFP组心肌细胞Hoechst 33342/PI双染色法检测结果提示,心肌细胞焦亡指数无明显变化,NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、ASC mRNA水平无明显改变,NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平无明显改变,统计分析发现以上差异均无统计学意义。（3）与H/R+GFP组相比:H/R+CHIP-GFP组心肌细胞Hoechst 33342/PI双染色法检测结果提示,心肌细胞焦亡指数明显降低;NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、ASC mRNA水平下降;NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平下降。统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:过表达CHIP可减轻缺氧/复氧介导的心肌焦亡,从而对心肌具有保护作用。