【摘 要】
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从嗜热菌中分离的酶具有一些优良的生物学性质,如热稳定性,以及对化学和物理变性剂、有机溶剂、极端pH等不利因素的抗性等。这些性质不仅可以作为设计和改造酶类的依据,而且在工业生产中极具价值,因此这方面的研究具有可观的经济前景。本实验所研究的目的蛋白二氢硫辛酰胺转乙酰基酶（E2）即是这样一种重要的嗜热酶。丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc）是一组限速酶,在细胞线粒体呼吸链能量代谢中起着重要的作用。E2在PDH
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从嗜热菌中分离的酶具有一些优良的生物学性质,如热稳定性,以及对化学和物理变性剂、有机溶剂、极端pH等不利因素的抗性等。这些性质不仅可以作为设计和改造酶类的依据,而且在工业生产中极具价值,因此这方面的研究具有可观的经济前景。本实验所研究的目的蛋白二氢硫辛酰胺转乙酰基酶（E2）即是这样一种重要的嗜热酶。丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc）是一组限速酶,在细胞线粒体呼吸链能量代谢中起着重要的作用。E2在PDHc中处于核心地位,E1和E3紧紧结合在E2周围有条不紊的发挥着生物学功能。本论文实验以嗜热菌Thermos thermopHiles HB8为材料,通过PCR技术扩增E2基因dlt,并将目的基因分别连接到克隆载体pGEM-T和表达载体pTrcHisC上,构建重组质粒。重组质粒pTrcHisC-dlt在大肠杆菌中于28℃的温度下诱导5-8 h表达。利用Ni-NTA金属亲和层析的方法从总蛋白中提取E2蛋白,然后通过透析超滤管浓缩获得纯度、浓度较高的E2蛋白溶液,最后对其进行酶动力学测定。本实验成功构建了表达dlt基因的载体,诱导表达并纯化出了具有生物学活性的E2,经过酶动力学测定得到该嗜热菌E2的下列酶动力学数据:其最适反应温度大约为58℃,反应活化能Ea约为93.38KJmol-1,最适反应pH值大约为7.6,Km值为1.323 mmol/L。本实验所取得的数据和经验拓展了丙酮酸脱氢酶复合体研究的物种范围,扩充了嗜热酶的研究种类和研究方法,为将来进一步对丙酮酸脱氢酶复合体和嗜热菌生理功能的研究奠定了基础。
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