刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)呈全球性分布,专性细胞内寄生,能导致人兽共患的弓形虫病。通常成人感染弓形虫多无症状,但孕妇、婴儿和免疫低下者感染后危害极大。牲畜感染弓形虫也给畜牧业造成严重的经济损失。迄今为止,弓形虫的诊断主要依靠病原学检测和血清学检测,且对该病的预防仍无理想的方法。本研究旨在建立弓形虫半巢式PCR检测体系,并对编码弓形虫主要表膜蛋白的P30基因进行了原核表达,同时构建P30基因的真核表达载体,为进一步研究以减毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗奠定基础。　　 弓形虫经小鼠腹腔传代后,取腹水,提取DNA,加入NTE后置-20℃备用。根据GeneBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了三条特异性引物P1、P2和P3,经PCR扩增及条件优化,该体系扩增出约250bp的目的片段。以外引物P1和P3扩增出约500bp的片段,将该扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。测序结果表明,该扩增片段与P30基因(X14080)的序列同源性为99.8％。该PCR检测体系不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;其最低检测的DNA含量为0.45pg,表明该检测体系具有较好的特异性和敏感性。　　 弓形虫速殖子的主要表膜蛋白P30能够刺激机体产生许多细胞因子和抵抗弓形虫感染的抗体。根据P30基因(X14080)再设计一对引物,在上下游引物分别加上酶切位点EcoRI和XhoI,以便于插入载体中。经PCR扩增后,回收该条带,将该PCR扩增片段连入pUCm-T载体中,构建pUCm-P30载体,并转化入Top10大肠杆菌感受态细胞中。pUCm-P30载体经EcoR I和Xho I切后,回收酶切后的P30片段,与同样经过酶切回收的pET-30(a)片段相连,构建pET-P30载体,转入BL21菌株中。测序后与参考序列(X14080)比较,核苷酸同源性为99.9％。取阳性菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量在25.0-35.0kDa之间;而且Westen-blot显示,纯化后的表达产物被鼠抗弓形虫阳性血清所识别。　　 pET-P30载体经EcoR I和Xho I酶征切后,回收酶切后的P30片段,与同样经过酶切回收的pcDNA3片段相连,构建pcDNA3-P30载体,转化入Top10大肠杆菌感受态细胞中,测序后与参考序列(X14080)比较,核苷酸同源性为99.9％。将鉴定阳性质粒再转化入减毒沙门氏菌中,成功构建以减毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗。　　 本研究成功建立了特异强、敏感性高的检测弓形虫的半巢式PCR方法;扩增了弓形虫P30基因,构建了弓形虫P30基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到高效表达;同时构建了真核表达载体,并将其电转入减毒沙门氏菌,为下一步研究DNA疫苗奠定了基础。