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手工克隆是近年来发展起来的一种新的核移植方法,由于整个过程不需要显微操作,技术含量底,节省了操作时间,而且降低了成本,所以越来越受到专家们的重视。由于去除了透明带,胚胎在致密化之前卵裂球之间容易相互分离,所以胚胎培养是手工核移植过程中最重要的一步。本实验利用检卵针烧成圆球状,在培养皿底烫制WOW,用来培养去透明带胚胎。实验1:为了探讨本方法制作的WOW培养体系对胚胎发育的影响,本实验将牛无透明带孤雌激活胚用此方法培养,验证此培养体系是否适合培养牛无透明带胚胎。将透明带去除分3种情况:移入离子霉素之前去除,移入6-DMAP之前去除,移入培养液之前去除,可以验证无透明带胚胎对离子霉素和6-DMAP敏感度的变化。本实验分别以5枚、15枚、30枚为一组,用WOW培养无透明带孤雌胚证明胚胎数不同是否对其发育有影响。结果表明:各组的卵裂率(81.1%、78.9%和78.9%)与对照组无显著差异(P>0.05);移入6-DMAP中之前去除组的囊胚率(31.5%)与移入培养液中之前去除组(32.4%)无显著差异(P>0.05),而且分别与对照组无差异显著(P>0.05);移入离子霉素中之前去除组未得到囊胚。移入6-DMAP中之前去除组囊胚细胞数(113.8±10.1)与移入培养液中之前去除组囊胚细胞数(112.5±8.1)和对照组均无显著差异(P>0.05)。分别5枚、15枚和30枚为一组进行培养,对胚胎的后续发育无显著影响。结论:本方法制作的WOW孔适合无透明带胚胎的培养;利用离子霉素和6-DMAP激活无透明带卵母细胞时,要降低离子霉素的浓度或(和)作用时间,而2 mmol/L6-DMAP对无透明带胚胎发育无影响;WOW培养法可以进行少数胚胎的培养,提高胚胎的发育率。实验2:收集卵母细胞853个,计算其成熟率。供体细胞消化不同程度(表面光滑的细胞和表面带有毛刺的细胞),重构胚利用微滴培养法培养,看对融合率、卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。将重构胚移入WOW中进行培养,四孔板的每个孔培养15枚,统计重构胚的卵裂率,囊胚率和囊胚细胞数。结果:成熟率较低(51.93%);表面带有毛刺的细胞作为供体细胞,其重构胚融合率(79.9%)与表面光滑的细胞作为供体细胞(64.2%)相比,具有差异显著性(P<0.05),而在卵裂率、囊胚率和细胞总数上没有差异显著性(P>0.05)。利用WOW培养法培养重构胚,与未用WOW培养法培养重构胚相比,囊胚率有所提高,且具有差异显著性(P<0.05),而在卵裂率和囊胚细胞数方面没有差异显著性。结论:在挑选供体细胞时,可以挑选表面带有毛刺的直径大小在25μm的细胞从而提高融合率;利用WOW培养法培养重构胚可以提高囊胚率。