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尿酸氧化酶(Urate Oxidase,EC 1.7.3.3)可以催化降解尿酸生成溶解度为尿酸十几倍的尿囊素,是嘌呤代谢过程的重要酶。由于生物进化过程中人体内的尿酸氧化酶基因突变,导致尿酸氧化酶失去活性,因此人体的尿酸含量一直较高,而过高的尿酸会引起痛风等一系列疾病。作为一种可以快速降低尿酸含量的酶,尿酸氧化酶在医学方面有着重大应用潜力。但是由于产量低,纯化较为复杂,其高额的成本使得在国内没有大规模推广应用,因此构建一株有高产尿酸氧化酶的基因工程菌株是非常有意义的。本文选用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主,过表达来源于黄曲霉的尿酸氧化酶的基因(uox),并对培养条件、密码子进行优化提高尿酸氧化酶产量,此外通过表达分子伴侣蛋白、转运因子、折叠因子和转录因子等方式进一步提高尿酸氧化酶产量。本论文主要工作如下:(1)在大肠杆菌BL21(DE3)中导入了来源于黄曲霉尿酸氧化酶基因(uox),构建了产尿酸氧化酶的基因工程菌株E.uox,尿酸氧化酶产量为2.09 mg/L。对尿酸氧化酶基因进行密码子优化,尿酸氧化酶的产量提高到2.66 mg/L。进一步地,对该重组菌株发酵过程中发酵时间、诱导剂添加量、诱导温度等条件进行优化,在发酵11 h后得到4.03 mg/L的尿酸氧化酶,经镍柱纯化后的尿酸氧化酶酶活为8.11 U/mg。为了进一步促进尿酸氧化酶表达,在菌株E.uox中分别导入了分子伴侣tig、dnaK-dnaj-GrpE、GroES-GroEL促进其翻译后折叠,产量分别提高至6.07 mg/L、6.66 mg/L、4.82 mg/L,而导入了分子伴侣tig-GroES-GroEL 的菌株产量有所下降,为3.15 mg/L。最后对发酵条件进行正交实验优化,在最优发酵条件下产量为8.77 mg/L,可溶性目的蛋白占总蛋白的62%。(2)以毕赤酵母GS115为宿主导入尿酸氧化酶基因uox,筛选高拷贝的菌株最终得到P.uox-11和P.uox-16两株菌株,发酵6天后发酵液酶活分别为0.746 U/mL和0.793 U/mL,纯化后的酶活为9.32 U/mg和9.41 U/mg,酶产量分别为80.04 mg/L和84.12 mg/L。通过验证拷贝数,得到了在筛选范围内拷贝数和酶表达量的粗略关系。(3)从P.uox-11菌株出发,从转运、折叠、转录三方面调控,提高酶表达量。在导入了折叠因子Sec53后产量没有明显提升。折叠方面通过表达PDI、Kar2p、CNE1折叠因子,发酵6天后发酵液中的酶表达量分别提高表至92.4 mg/L、96.1 mg/L和87.3 mg/L,酶表达量分别提高了 18.4%、22.8%和11.9%。转录方面通过表达HAC1转录因子提高酶表达量至100.3 mg/L,酶表达量高了 28.6%,构建了有较高产量的尿酸氧化酶分泌型表达菌株。最后,通过正交试验优化,对表达了 PDI折叠因子的菌株进行发酵条件优化,最终酶表达量达到了 104.5 mg/L,提高了13.1%。